2. 天津中医药大学, 天津 300193;
3. 天津市职业与环境危害防制重点实验室, 天津 300162
2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;
3. Tianjin Key Laboratory for Prevention and Control of Occupational and Environmental Hazards, Tianjin 300162, China
随着经济的迅速发展和工业化的不断推进，环境问题日益凸显。环境与生殖健康成为人们热议的话题，环境对胚胎的影响也备受瞩目，成为当下学者关注的热点。化学环境污染物与人类生育能力降低、不良妊娠结局及子代出生缺陷密切相关[1, 2, 3, 4]。多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)类化合物是人们日常能接触到的一类环境污染物[5],主要来源于不完全燃烧的有机物，如焚烧的垃圾、汽车尾气及烧烤的食物等等[6]。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)是多环芳烃类环境污染物中典型的一种，可经由呼吸、饮食等多种途径进入母体并透过胎盘屏障，在胚胎发育过程中通过氧化损伤和凋亡等途径产生胚胎毒性，进而影响胚胎的正常发育[7]。五味子是久负盛名的补肾固涩类中药，神农本草经列为上品，具补益强壮之功、奏固涩生津之效，能对人体五脏——心、肝、脾、肺、肾发挥平衡作用，中国药典将其列为补益类和镇静类中药[8]。现代药理研究表明，五味子的主要有效成分具有抗炎、抗凋亡等多种作用[9, 10, 11]。我们前期研究发现，妊娠后BaP暴露可以产生早孕期胚胎毒性，本研究采用妊娠前BaP染毒并加用中药五味子提取物灌胃，分组观测妊娠早期SD大鼠的各项指标，旨在明确妊娠前BaP暴露同样对早孕期大鼠胚胎造成生殖损伤，揭示五味子提取物对其早孕期生殖毒性的抑制作用，并对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级健康未生育8周龄SD大鼠150只，♀♂各半。♀鼠入室体质量(200±20) g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2009-0004。♀大鼠的发情周期由阴道脱落细胞学检查确定，动周期在4~7 d的♀大鼠备选入组。饲养条件：室温恒定于(22～26)℃，通风，相对湿度55%～65%，光照时间为12 h/d。♀♂鼠分开饲养于标准饲养盒内，每盒5只。饲料为SPF 级繁殖鼠料，食物和纯净水可自由摄取。动物入室后经1周平衡适应期再行后续实验。
1.2 药品、试剂及主要仪器五味子提取物的主要活性成分：五味子总素≥25%，五味子甲素 ≥6.3%，五味子乙素 ≥ 18.0%，五味子醇甲 + 五味子醇乙 + 五味子酯甲 ≥ 0.7%(陕西帕尼尔生物科技有限公司)；3,4-Benzopyrene(日本TCI公司，纯度 ≥ 96%)；羟甲基纤维素钠(天津市精细化工研究所)；体积分数为0.009的氯化钠注射液(河北天成药业)；大鼠绒毛膜促性腺激素β(β-CG)ELISA Kit、大鼠孕激素 / 孕酮(PROG) ELISA kit( 武汉华美生物工程有限公司)；Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(上海生工)；Bax兔抗大鼠多克隆抗体(ab7977)、Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗体(ab7973)、caspase-3兔抗大鼠单克隆抗体(ab32351)均为Abcam公司产品；山羊抗兔IgG(H+L)/HRP(北京中杉金桥，ZB-2301)；组织蛋白抽提试剂盒(上海生工，BSP003)；小型垂直电泳槽、凝胶成像系统、电泳仪(美国BIO-RAD公司)；Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo公司)。
1.3 动物分组及处理75只♀鼠随机分为5组，每组15只。大鼠晨起于每日8 ∶ 00～9 ∶ 00灌胃。BaP模型组给予BaP 2 mg·kg-1·d，五味子低、中、高剂量组分别给予五味子提取物40、200、1 000 mg·kg-1·d-1+BaP 2 mg·kg-1·d-1，正常对照组给予相同体积的生理盐水。BaP以质量分数为1%羧甲基纤维素钠为助溶剂配成混悬液，配好后4 ℃避光保存。各组药物给药剂量均为1 mL·(100 g)-1。灌胃15 d后，停药并开始制备孕鼠模型，采用性周期筛选合笼法[12]，即通过阴道涂片显微镜检(10×10)，发现大量椭圆形有核上皮细胞即判断为♀鼠发情前期，将处于发情前期的♀鼠按照♀ ∶ ♂=1 ∶ 1比例合笼，自合笼d 2起每天上午8 ∶ 00开始进行阴道涂片观察( 棉签蘸取氯化钠注射液取大鼠阴道分泌物)，并结合脱落的阴栓确定为孕0 d，以此推算孕龄。剔除未造模成功的大鼠，最终从每组组内随机选取10只孕鼠，共50只。各组妊娠大鼠于孕d 9(gestational day 9,GD 9)用颈椎脱臼法处死，并称取孕鼠相关组织器官进行检测。
1.4 观察指标及样品处理观察孕鼠一般状态、外观体征、行为活动及摄食情况，测定♀鼠体质量，给药前、给药d 5、d 10、d 15(给药结束)、GD 0、GD 4及GD 9(处死前)各测定1次。于妊娠d 9处死孕鼠，股动脉取血，静置2 h后，2 500 r·min-1离心5 min，留取血清行大鼠血清β-CG及PROG ELISA检测。切开腹部暴露两侧子宫，将子宫完整切下并剥离周边脂肪组织。称取脏器质量(子宫及胚胎总质量)，计算脏器系数，脏器系数/%=脏器质量(wwt，湿重，g) / 体质量(g)×100%。称重后，剥离胚胎组织，观察胚胎组织的外观形态，放入液氮罐中，再转移至-80 ℃冰箱保存备用。
1.5 总RNA提取及Real-time PCR检测孕鼠胚胎Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA各组大鼠胚胎样本加入1 mL的TRIzol提取RNA。取RNA样品，紫外分光光度计测定样品RNA在波长260 nm和280 nm的紫外光吸收值，吸光度A=OD260/OD280，吸光度比值在1.8～2.0之间视为抽提的RNA纯度较高，提取的RNA -80 ℃保存。取6 μL的原始RNA进行反转录反应，cDNA的量是原始浓度稀释10倍进行荧光定量PCR检测(具体操作步骤按照SYBR Green试剂盒说明进行)。所有PCR引物(Primer Premier 5.0软件设计)均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，需要扩增的目的基因引物序列及片段长度见下表(Tab1)：
用于定量检测的荧光染料在Hot start fluo-PCR mix SYBR Green Ⅰ中已添加，反应体系20 μL：Hotstart Fluo-PCR mix(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)1 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，cDNA 1 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃终延伸10 min。40个循环72 ℃检测荧光信号。完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在Bio-Rad CFX96型荧光定量PCR仪中进行反应，并绘制PCR 产物的融解曲线。每个样品设3个平行孔，目的基因(Bax、Bcl-2和caspase-3)及内参照基因(GAPDH)均采用相对定量，各基因的相对表达水平以2-△△Ct来表示(△Ct = Ct目的基因-Ct GAPDH，△△Ct = △Ct处理组-△Ct对照组)。
1.6 蛋白提取及Western blot检测孕鼠胚胎Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达各组大鼠脱臼处死后，剖腹剥取胚胎组织提取总蛋白。将胚胎组织用PBS清洗后裂解并研磨，离心取上清测蛋白浓度。Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪进行蛋白定量，根据测定的蛋白质浓度，确定待检测蛋白样品上样量为30 μg。取蛋白样品加入4×loading buffer后，100 ℃煮沸变性5 min。以体积分数为0.1的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用湿法转移到PVDF膜上。体积分数为0.05脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。TBST漂洗后，加入一抗：Bax兔抗大鼠多克隆抗体(1 ∶ 100稀释)、Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗体(1 ∶ 500稀释)、caspase-3兔抗大鼠单克隆抗体(1 ∶ 5 000稀释)4 ℃孵育过夜。TBST漂洗后，根据一抗加入对应的二抗，羊抗兔-HRP(1 ∶ 20 000稀释)室温摇床孵育1 h，洗膜后，采用ECL化学发光法显色、曝光。用凝胶分析软件Image J进行定量分析。
1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析处理。数据对称分布时，采用
表示；用单因素方差分析进行组间两两比较。方差齐时采用LSD检验进行两两比较；方差不齐时采用Dunnett’s T3检验进行两两比较。数据呈偏态分布时，采用非参数检验法进行数据分析。
正常对照组及五味子高、中、低剂量组大鼠一般状态好，外观未见明显异常，被毛光泽，活动佳，摄食正常，体重增加，二便正常，未见其他病理反应。模型组大鼠给予BaP染毒后体毛晦暗无光泽，活动差，嗜睡，对外界刺激欠敏感，摄食减少，体重增加不明显或减轻，二便减少。
2.1.2 胚胎一般状态观察正常对照组及五味子高、中、低剂量组大鼠胚胎大小均匀，色泽良好，外观形态无异常，胚胎表面未见出血点及淤血斑块。模型组大鼠胚胎大小不均，数量少，色泽晦暗，肉眼观体积小于其他各组，且有异常出血点及淤血斑块形成(Fig1)。
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| Fig 1 Changes in embryonic morphology of rats found in each group A:Control group: the embryos were uniform, bright in color, no abnormal bleeding on the surface; B:SCE groups: there was no obvious change on the surface of embryo compared with control group(a:SCE 40 mg·kg-1 group; b: SCE 200 mg·kg-1 group; c: SCE 1 000 mg·kg-1 group); C:Model group: the embryos were unevenly sized, dark and gloomy in color, abnormal blood stasis on the surface. |
各组大鼠给药前、给药d 5、给药d 10体质量无明显变化，差异均无统计学意义(P＞0.05)。给药d 15、GD 0、GD 4、GD 9，BaP模型组大鼠体质量增长缓慢，明显低于正常对照组及五味子高、中、低三个剂量组，且体质量差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。正常对照组与五味子低、中、高剂量组四组间比较，大鼠体质量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05),见Fig2。
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| Fig 2 Changes in weight of each group (n=10) 1: Before treatment; 2: Intragastric administration for ten days; 3: Intragastric administration for fifteen days; 4: Gestational day 0(GD 0); 5: Gestational day 4(GD 4); 6: Gestational day 9(GD 9). |
至GD 9，BaP模型组孕鼠的子宫连胚总系数明显低于正常对照组(P＜0.01)及五味子高、中、低三个剂量组(P＜0.05或P＜0.01)。五味子低、中、高剂量组孕鼠子宫连胚总系数水平较模型组明显升高，其中低、中剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，高剂量组与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)。正常对照组与五味子低、中、高剂量组四组间比较，孕鼠脏器系数无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05),见Fig3。
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Fig 3
Changes in organ coefficient (pregnant uterine total coefficient) of each group (, n=10)
1: Model；2, 3 and 4: SCE 40, 200,1 000 mg·kg-1 group, respectively; 5:Control. **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.
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至GD 9，BaP模型组孕鼠的血β-CG及PROG水平均明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)(见Fig4)；五味子中、高剂量组大鼠血β-CG水平高于BaP模型组，与BaP模型组相比，中剂量组有统计学差异(P＜0.05)，高剂量组差异有显著性(P＜0.01)(见Fig4A)。五味子低、中、高剂量组大鼠血PROG水平较模型组明显升高，其中低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，中、高剂量组与模型组相比差异有显著性(P＜0.01)(Fig4B)。正常对照组与五味子低、中、高剂量组四组间比较，大鼠血β-CG及孕酮水平无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。
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Fig 4
Changes in levels of serum rat β chorionic gonadotropin(A) and progesterone(B) (, n=10)
1: Model; 2, 3 and 4: SCE 40, 200, 1 000 mg·kg-1 group, respectively; 5: Control; **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.
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Real-time PCR数据结果表明，与正常对照组大鼠相比，BaP模型组大鼠胚胎中Bax、caspase-3 mRNA表达明显升高( P＜0.01)；与BaP模型组比较，各剂量五味子组均可不同程度降低Bax、caspase-3 mRNA表达。其中，与模型组相比，低剂量五味子组及中、高剂量五味子组Bax、caspase-3 mRNA明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，且趋势一致(Fig5A、C)。与BaP模型组相比，低剂量五味子组Bcl-2 mRNA表达无明显变化，中、高剂量五味子组Bcl-2 mRNA表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)(Fig5B)。与正常对照组相比，五味子低、中剂量组Bax mRNA水平升高(P＜0.05或P＜0.01)，五味子高剂量组Bax mRNA水平与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)；正常对照组与五味子低、中、高剂量组四组间比较，孕鼠胚胎Bcl-2及caspase-3mRNA表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。
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Fig 5
Effect of SCE on Bax (A), Bcl-2 (B) and caspase-3 (C) mRNA expressions in embryonic tissue of rats by Real time-PCR (, n≥3)
1: Model; 2, 3 and 4: SCE 40, 200, 1 000 mg·kg-1 group, respectively; 5: Control. A, B and C was the △△Ct result, respectively. **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.
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Western blot实验分析结果显示，正常对照组大鼠胚胎中有少量Bax及caspase-3蛋白表达，与正常对照组相比，BaP模型组大鼠胚胎中Bax、caspase-3蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与BaP模型组比较，各剂量五味子组均可不同程度降低Bax、caspase-3蛋白表达。其中，与模型组相比，低剂量五味子组及中、高剂量五味子组Bax蛋白明显降低(P＜0.05或P＜0.01)(Fig6A)。低剂量五味子组caspase-3蛋白表达较BaP模型组无明显变化，但中、高剂量五味子组caspase-3蛋白明显降低(P＜0.05或P＜0.01)(Fig6C)。由Fig6B结果显示，正常对照组Bcl-2蛋白表达较高，模型组Bcl-2蛋白表达明显降低( P＜0.01)，与模型组相比，低、中、高五味子组均可明显升高Bcl-2 蛋白表达(P＜0.01)。与正常对照组相比，五味子低、中剂量组Bax蛋白表达水平升高(P＜0.05或P＜0.01)，五味子高剂量组Bax蛋白表达水平与正常对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。与正常对照组相比，五味子低、中剂量组Bcl-2蛋白表达水平升高(P＜0.05)，五味子高剂量组Bcl-2蛋白表达水平与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)；正常对照组与五味子低、中、高剂量组四组间比较，孕鼠胚胎caspase-3蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。
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Fig 6
Effect of SCE on Bax ( A), Bcl-2 (B) and caspase-3 ( C) protein expressions in embryonic tissue of rats by Western blotting (, n≥3)
1: Model; 2, 3 and 4: SCE 40, 200, 1000 mg·kg-1 group, respectively; 5: Control. **P＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P＜0.01 vs model group.
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在多环芳烃类化合物中，以BaP的分布最广、致癌性最强，其性质稳定，常存在于食品、香烟烟雾及被污染的空气中，可对各种生物体产生广泛的毒性[13]。国内外众多学者对这一典型环境污染物进行了多方面研究，但涉及生殖系统毒性的研究还未广泛开展。我们前期研究发现，BaP对妊娠早期胚胎和绒毛组织具有一定的损伤作用，是孕早期胚胎停育发生的危险因素[14, 15]。本研究通过妊娠前经口灌服BaP的给药途径造成大鼠妊娠早期胚胎损伤模型，旨在观察并明确妊娠前期的BaP暴露同样会对妊娠早期的母体及胚胎发育产生毒性作用。实验结果表明，染毒后大鼠体质量增长缓慢，孕鼠子宫连胚总系数明显下降，大鼠血β-CG及孕酮水平明显降低，均显示BaP对大鼠母体及胚胎产生毒性作用，抑制胚胎正常着床及生长发育，对绒毛组织产生了一定的损伤，从而抑制了妊娠期母体体内相关激素的分泌和释放，揭示出妊娠前BaP暴露对孕早期胚胎的毒性作用，同时也显示BaP的生殖毒性在体内是一个慢性蓄积的过程，即使孕早期暴露、妊娠后脱离暴露环境，毒性依旧能持续存在于机体并对其产生各种毒性作用，引起损伤。
明确BaP对胚胎产生的生殖毒性后，我们试图进一步揭示BaP诱导胚胎损伤的深层机制。研究表明，BaP能诱导多种细胞发生凋亡[16, 17]。因此，我们设想BaP可以诱导胚胎组织和细胞凋亡，从而引起生殖毒性。在本研究中选择以下典型凋亡指标进行检测：Bcl-2、Bax以及 caspase-3。细胞凋亡是一个复杂的生命过程，凋亡相关蛋白中Bcl-2家族是凋亡的关键调节因子，其中包括抑制凋亡和促进凋亡两类，二者协调作用共同完成凋亡的过程。Bcl-2和Bax这两个同源基因的蛋白水平高低与凋亡调控直接相关：Bcl-2高表达，形成异源二聚体抑制细胞凋亡；Bax高表达,形成同源二聚体促进细胞凋亡[18]。caspase家族在诱导细胞凋亡的过程中也起着关键性作用，是众多凋亡通路的交汇点，也是执行凋亡的最终途径。其中，caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在凋亡中发挥至关重要的作用[19]。本研究发现，孕前BaP暴露导致的受损胚胎中促凋亡基因Bax及caspase-3的mRNA水平及蛋白表达上调，抑凋亡基因Bcl-2的mRNA水平及蛋白表达下调，说明BaP可能通过改变Bcl-2、Bax异源二聚体的调控平衡，促进caspase-3的活性，进而诱导早期胚胎发生凋亡。
BaP致胚胎损伤的保护性研究尚少，寻找对抗BaP致胚胎损伤的药物成为焦点。五味子科植物以其在保胎方面独特的优势而备受瞩目，已成为天然产物化学及药理学研究的一个热点。本研究发现五味子中药组经五味子提取物干预后，大鼠孕早期体质量、子宫连胚总系数、大鼠血β-CG及孕酮水平较单纯BaP模型组有明显改善，与正常对照组相比无显著性差异。此外，五味子中药组可以使Bax及caspase-3的mRNA水平及蛋白表达下调，Bcl-2的mRNA水平及蛋白表达上调，协调凋亡因子的平衡，表明五味子提取物对环境污染物BaP所致胚胎毒性具有一定的拮抗作用，抑制胚胎及绒毛组织的凋亡，从而发挥保胎的作用。
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