2. 济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院, 山东 济南 250062
2. School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China
随着人们生活水平的提高以及肥胖发生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，心血管并发症是DM患者死亡的主要原因。Wnt/β-catenin信号通路作为一条保守的信号传导通路广泛存在于各生物体中，参与调控细胞增殖、迁移、分化等细胞发育过程。近年来研究表明，Wnt/β-catenin信号通路参与心肌细胞生长和分化[1]，在心血管疾病中起重要作用[2]。此外，Wnt/β-catenin信号通路的异常可能引起代谢综合征[3]。本文通过检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白在2周 DM大鼠心肌中的表达，探讨该信号通路在早期DM心肌中的表达变化，为糖尿病心肌病的治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物及模型建立SPF级♂Wistar大鼠20只，体重180~220 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)2013-0001，使用许可证号：SYXK(鲁)2014-0007。造模前禁食16 h，用新鲜配制的链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，按60 μg·g-1剂量随机对10只大鼠一次性腹腔注射，另设正常对照组10只，注射等量溶剂。72 h后尾静脉采血检测空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)，以FBG≥16.7 mmol·L-1，并出现多饮、多食、多尿和体重下降者为DM模型成功。
1.2 材料与试剂STZ(美国Sigma公司，批号：046K1206)；血糖试纸(强生中国医疗器材有限公司)；SABC免疫组化染色试剂盒(SA1020，武汉博士德生物技术有限公司，批号：08C11B)；浓缩型DAB试剂盒、二抗辣根酶标记山羊抗兔/小鼠抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Western一抗、二抗去除液、Western转膜液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购自碧云天生物技术研究所；ProSieve Color ptrotein makers(美国Lonza Rockland公司)；PVDF膜(0.45 μm，美国SERVA公司)；增强型化学发光试剂(美国Millipore公司)；所用单克隆抗体为：Wnt2(3169-1，美国Epitomics公司，批号：YJ041913P)，DKK1(3435-1，美国Epitomics公司，批号：YJ110203CS)；β-catenin(9562S，美国Cell Signaling Technology公司，批号：11)；c-Myc(SC-40，美国Santa Cruz公司，批号：C0613)，β-actin(E0012，美国Ambobio公司，批号：012573)。
1.3 仪器Wallac1420型多标记计数仪(美国Perkinelmer公司)；RM2235型石蜡包埋机、EG1150型切片机(德国Leica公司)；J-25型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；LAS4000型化学发光成像仪(日本Fujifilm公司)；Eclipse TE 2000-S型免疫荧光显微镜(日本Nikon公司)。
1.4 标本收集大鼠麻醉，开胸，迅速取出心脏，用预冷生理盐水洗净，剔除血管、脂肪等非心肌组织，滤纸吸干水分后称心脏重量和左心室(含室间隔)重量，并计算心脏(左心室)指数=心脏(左心室)重量(mg)/体重(g)。分离的左心室再分为两部分：第一部分用福尔马林固定，经脱水、透明、包埋，制成心肌组织石蜡块；第二部分置于EP管，于液氮中保存待用。
1.5 HE染色取石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染色10 min，流水稍洗，体积分数为0.01的盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，伊红染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察心肌组织病理结构的改变。
1.6 Western blot每20 mg心肌组织中加入100~200 μl含1 mmol·L-1 PMSF的裂解液，制备组织匀浆，4 ℃下14 000×g离心10 min，取匀浆上清，BCA法测定总蛋白浓度。每孔上样30~50 μg总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后冰浴下恒流(300 mA)湿法转膜2 h，质量分数为5%的脱脂奶粉室温封闭1 h后，与相应一抗4 ℃共孵育过夜，抗体稀释比例分别为Wnt2(1 ∶ 2 000)、β-catenin(1 ∶ 1 000)、c-Myc(1 ∶ 500)及DKK1(1 ∶ 1 000)。次日TBS-T洗液(PH 7.6)洗涤后，与辣根酶标记的二抗共孵育，用增强型化学发光试剂进行显色，并利用AlphaEaseFC 4.0灰度分析软件定量分析，以β-actin的灰度值标化蛋白表达。
1.7 免疫组化(IHC)取石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS，PH 7.4)洗涤，浸入体积分数为0.03的过氧化氢封闭液中，室温封闭30 min，以阻断内源性过氧化物酶。枸橼酸缓冲液(0.01 mol·L-1，PH 6.0)高压3 min以修复抗原，自然冷却至室温。PBS洗涤后滴加一抗，4 ℃湿盒过夜，抗体稀释比例分别为Wnt2(1 ∶ 300)、β-catenin(1 ∶ 1 800)及c-Myc(1 ∶ 200)。次日切片恢复至室温后，分别滴加二抗和辣根酶标记工作液，37 ℃温箱分别孵育20 min。PBS洗涤后DAB显色，苏木精轻度复染，自来水水洗返蓝，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察结果。每组随机取10个视野，通过Image-Pro Plus6.0图像分析系统测定平均积分光密度值(IOD)。
1.8 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，所有数据均以
表示，各项指标组间差异比较采用t检验。
实验期间，正常对照组大鼠一般状态良好、健壮、皮毛有光泽，对外界反应灵敏。与正常对照组比较，DM组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛无光泽，腥臊酮臭味加重等。造模成功9只。
2.2 大鼠体重及心脏各指标的测定结果2周后，正常对照组大鼠体重增加，FBG正常，与正常对照组相比DM组大鼠体重、心脏及左心室重量均明显降低(P＜0.05)，FBG明显升高(P＜0.01)，心脏指数和左心室指数均高于对照组(P＜0.05，Tab1)。
正常对照组大鼠心肌纹理清晰，心肌细胞排列整齐，细胞核均匀分布，无变性、坏死等病理结构改变。DM组9只大鼠中有7只观察到不同程度的病变，其心肌细胞胞质丰富，细胞核形状不规则，排列紊乱，局部可见心肌细胞变性、坏死(Fig1)。
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| Fig 1 Changes of cardiac pathological structure (HE×400) A：Control;B:2 wk DM |
Western blot实验结果(Fig2)表明,2周DM大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc蛋白的表达相对于正常对照组明显增加(P＜0.01)，但DKK1的表达变化不明显(P=0.885)。IHC结果(Fig3)显示正常组大鼠心肌中各蛋白表达均匀分布，DM组大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc的表达均明显增加，其中β-catenin伴随少量核表达，c-Myc在细胞质和细胞核中表达均增加。
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Fig 2
Myocardial expression levels of Wnt2, β-catenin, c-Myc and DKK1 tested by Western blot (,n=4)
**P＜0.01 vs control
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| Fig 3 Myocardial expressions of Wnt2, β-catenin and c-Myc tested by immunohistochemistry (×400) Black arrows pointing to the nucleus expression；n=10 random fields for each group, **P＜0.01 vs control |
DM时胰岛素分泌减少，葡萄糖利用不足，脂肪组织脂解增加，从而导致游离脂肪酸的堆积，在此基础上出现氧化应激、线粒体损伤，进而导致细胞凋亡、炎症反应增加和心肌纤维化等病理改变，同时出现心肌结构和功能的改变[4, 5]。本研究中，2周DM大鼠FBG明显升高，体重明显低于正常对照组，2周DM大鼠心肌出现局灶性心肌细胞变性、坏死，表明DM早期出现心肌损伤。但本实验未观察到明显心肌肥大，其中大鼠心脏指数和左心室指数的增加可能与DM大鼠体重的降低有关。
Wnt/β-catenin信号通路是近年来在分子生物学、细胞生物学和肿瘤学中的研究热点之一，其在心肌损伤中的作用也被广泛关注。实验性心肌梗死后Wnt2的表达增加[6]，β-catenin的抑制有益于成人左心室重塑[7]，扑蛲灵(pyrvinium)作为Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂能明显改善心肌重塑[8]。这些研究表明，Wnt/β-catenin信号通路参与心肌损伤。此外，研究发现早期Wnt/β-catenin信号通路的异常会引起糖代谢的异常[9]，增加2型糖尿病的风险[10]，并参与高糖介导的肾上皮细胞转分化过程[11]。因此，我们推测Wnt/β-catenin信号通路可能在DM心肌损伤中起重要作用。
Wnt/β-catenin信号通路转导过程中，Wnt蛋白与细胞膜上的跨膜受体结合，促使β-catenin降解复合体轴蛋白/结肠腺瘤样息肉蛋白/糖原合成酶激酶3β(Axin/APC/GSK-3β)解聚而失活，抑制β-catenin的磷酸化及降解，促进β-catenin发生核转移，与核内转录因子Tcf/Lef结合，激活下游靶基因启动基因转录[2]。本研究中Western blot及IHC结果表明,2周DM大鼠心肌Wnt2的表达增加，促进β-catenin发生核转移，从而增加下游靶基因c-Myc的表达，β-catenin及下游靶基因表达的增加可能引起早期DM大鼠心肌细胞的变性、坏死，并进一步引起心肌肥大、心肌纤维化等病变[7, 12]。但DKK1作为Wnt/β-catenin信号通路的内源性抑制剂，在2周DM大鼠心肌中尚没有明显变化，其在DM心肌发展过程中的表达还需要进一步研究。
糖尿病心肌病是糖尿病性心脏病的特异性病变，是糖尿病心血管严重并发症的重要组成部分，明确其发生发展机制，进而阻滞其发展成为研究热点。本实验揭示Wnt/β-catenin信号通路的激活参与早期DM心肌损伤，我们将进一步研究其在DM心肌发展过程中的作用机制，以期为糖尿病心肌病的治疗找到新的靶点。
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