2. 安徽医科大学药学院, 安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学生物药物研究所, 安徽 合肥 230032
2. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230001;
3. Institute of Biopharmaceutical Research, Anhui Medical University, Hefei 230001
Tau 蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布在神经元，其功能是与微管蛋白结合，促进微管的形成并保持其稳定性，对维持神经细胞骨架完整性和正常轴突运输起着重要的作用。在病理状态下，tau 被高度磷酸化失去结合微管的能力，聚集并形成成对螺旋丝(paired helical filament,PHF)，从而导致细胞骨架异常及细胞死亡。因此，PHF-tau 组成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理性标记物之一，也广泛存在于其他神经退行性疾病中[1]。国际学术界将这类有异常tau蛋白聚集的神经变性疾病称之为tau蛋白病[2]。神经细胞内非正常状态tau蛋白的存在，无论是tau不溶性的聚集体、还是可溶性的寡聚体，无论是修饰的还是未修饰的(如磷酸化和非磷酸化)，都可能影响细胞的功能状态[3]。因此，增加细胞内非正常状态tau蛋白的降解，可能是抑制tau的毒性和保护神经元的有效策略之一。
细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种高度保守的溶酶体依赖性的降解程序。在营养缺乏、应激等条件下，它可以通过降解细胞内长寿命蛋白质和细胞器，获得必需的氨基酸、脂肪酸、核酸等营养物质，有利于维持细胞自我稳态，促进细胞生存[4]。因此，自噬在细胞发育、细胞免疫、组织重塑、以及环境适应等方面起着十分重要的作用。近来研究发现自噬功能缺陷与神经退行性疾病的发生发展密切相关，而这些疾病的显著特点就是大脑神经元内蛋白的异常聚集。因此通过自噬清除神经元内异常聚积的蛋白，维持神经元正常功能显得尤为重要。临床上对AD病人脑皮层活检标本进行研究，发现神经元内自噬小体显著增加[5, 6]；敲除自噬相关基因Atg5/Atg7的大鼠出现典型的神经元退化[6, 7]，提示自噬在神经退行性疾病中可能扮演了极为重要的角色。目前自噬参与tau降解的研究很多，但对于不同形式tau蛋白是否通过自噬降解还存在着争议。有研究认为磷酸化tau的聚集体倾向于自噬降解，蛋白酶体主要降解可溶性tau；也有研究发现不论是可溶的还是不可溶的tau都可以通过自噬降解[8, 9]。为了更好地了解自噬在tau蛋白降解中的作用，我们采用表达内源性tau的神经细胞，建立过表达tau或tau过度磷酸化的细胞模型，观察自噬对神经细胞内不同形式tau蛋白降解的影响；同时观察自噬抑制对tau细胞毒性的影响，为全面了解tau蛋白的降解机制提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 试剂及抗体Atg5基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株(Atg5-/- MEFs)受赠于中科院生物物理所张宏教授；表达红色荧光蛋白的Lamp1-RFP重组质粒受赠于美国马里兰大学方圣云教授；pEGFP-C1-tau真核表达质粒由本实验室构建[10]，DMEM高糖培养基、Opti-MEM和EBSS培养液购自Gibco公司；lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；小牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司；ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司，溶酶体抑制剂氯化氨(NH4Cl)购自上海生工，自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin)购自Santa Cruz，冈田酸(okadaic acid,OA)和放线菌酮(cycloheximide,CHX)购自Sigma公司，tau-5单克隆抗体购于Biosourse公司，AT-8单克隆抗体购自Pierce公司，LC3、p62、GAPDH和α-tubulin多克隆抗体购自Sigma公司，GFP抗体购于Abmart公司，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG(H+L)购自Invitrogen公司，DAB显色试剂盒购自中杉金桥公司。
1.2 实验方法 1.2.1 质粒转染小鼠神经瘤母细胞株N2a培养于含10%小牛血清、105 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM培养液中，培养条件为37 ℃，5% CO2。转染前取对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化后重新接种于6孔板中，细胞密度为3~5×105个/孔。待细胞生长至60%～70%汇合后，采用脂质体 Lipofectamine 2000转染质粒，操作方法参照转染试剂说明书，转染后的细胞继续培养6 h后更换培养液。转染后24 h，荧光显微镜观察质粒转染效率，通过计算5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数比值作为转染阳性率，pEGFP-C1空载体和pEGFP-C1-tau的转染效率分别为(87.0±4.1)%、(75.0±2.3)%。
1.2.2 蛋白质免疫印迹转染后24 h，培养液中加入终浓度为10 nmol·L-1的OA处理细胞12 h，对照组加入等体积的溶媒二甲基亚砜(DMSO)，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，100 ℃变性10 min，SDS-PAGE胶电泳后湿转至PVDF膜。用含0.5 g·L-1脱脂奶粉和0.05%吐温20的PBS(PBST)封闭30 min后，加入适当稀释度的一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗10 min×3次，加入适当稀释度的二抗，室温结合2 h，PBST洗10 min×3次，ECL显影。扫描以后用Photoshop CS软件进行分析。
1.2.3 CHX示踪实验MEFs细胞转染GFP-tau，转染后24 h加入OA处理12 h诱导tau蛋白磷酸化，全量更换为EBSS培养液诱导细胞自噬，同时加入CHX(100 mg·L-1)抑制细胞蛋白质合成，分别于EBSS孵育0、3、6和9 h收集细胞进行裂解，蛋白免疫印迹方法同前。
1.2.4 细胞免疫荧光染色和DAB染色接种于24孔板的细胞去除培养液，4 %多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS洗5 min×3次，用含1.0 g·L-1牛血清白蛋白和1.0 g·L-1 皂素的PBS于4 ℃透膜封闭处理0.5 h，加入一抗37 ℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，依次加SP试剂盒中的B和C液，DAB显色；PBS洗5 min×3次后加入适当稀释度的一抗37 ℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，加入适当稀释度的荧光二抗37 ℃避光孵育1 h，DAPI (5 mg·L-1)孵育10 min衬染核，PBS洗5 min×3次，共聚焦显微镜或荧光显微镜采集图片。
1.2.5 统计学分析 计量资料的数据以
表示，组间差异的显著性检验采用方差分析。
自噬激活剂rapamycin(10 mg·L-1)或溶酶体抑制剂NH4Cl(25 mmol·L-1)处理N2a细胞6 h，tau-5抗体检测内源性tau蛋白水平，并以微管相关蛋白1轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和自噬底物蛋白p62的变化作为检测细胞自噬水平的指标。结果如Fig1A所示，NH4Cl处理组LC3 Ⅱ型与 Ⅰ型的比例显著增加，同时p62水平升高，提示细胞自噬抑制；而rapamycin处理组LC3 Ⅱ型与Ⅰ型的比例增加，伴有p62减少，提示细胞自噬激活；与溶媒对照组相比，NH4Cl或rapamycin处理组细胞内源性tau水平无明显变化，提示自噬不参与内源性tau的降解。
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Fig 1
Effect of autophagy on levels of tau and hyperphosphorylated tau in Neuro2A cells
A: The levels of endogenous tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; B: The levels of overexpressed tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; C: The levels of hyperphosphorylated tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; D: The quantitative analyses for tau proteins of the results in panel B. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments; E: For quantitative analyses of the results in panel C, the bands around molecular mass of 79 kDa for phosphorylated tau and 150kDa for tau oligomers were included. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. *P＜0.05, **P＜0.01 vs control. |
N2a细胞分别转染GFP-vector和GFP-tau质粒，转染后24 h，同上采用rapamycin和NH4Cl处理细胞6 h后检测细胞内GFP-tau蛋白水平。结果发现，与溶媒对照组相比，NH4Cl处理组细胞GFP-tau表达升高，而rapamycin处理后GFP-tau水平明显降低(Fig1B，D)，提示自噬降低神经细胞内过表达tau的水平。
2.3 自噬对N2a细胞中磷酸化tau水平的影响同上转染细胞，用OA(10 nmol·L-1)处理细胞12 h诱导tau过度磷酸化，同上加入rapamycin或NH4Cl处理细胞6 h，分别采用AT-8和tau-5抗体检测细胞内磷酸化tau和总tau蛋白水平。结果如Fig1C和E所示，NH4Cl处理组细胞中总tau水平明显上调，AT-8抗体识别的Ser202/Thr205位点磷酸化tau蛋白水平增加；而rapamycin 处理组细胞中磷酸化tau形成的高分子量寡聚体(150 kd左右)明显减少[11](Fig1C箭头所示)。提示自噬降低神经细胞内磷酸化tau蛋白的水平，尤其是磷酸化tau寡聚体水平。
2.4 自噬参与tau和磷酸化tau的降解为了进一步明确tau蛋白水平的降低是由于降解增加所致，我们采用CHX示踪实验观察tau的降解情况。结果如Fig2所示，随着饥饿诱导自噬时间的延长，正常MEFs组细胞中tau水平逐渐降低，而自噬功能缺陷的Atg5-/- MEFs细胞中，tau降解速度明显减慢。提示自噬参与tau的降解。同上转染MEFs细胞后，加入OA处理12 h诱导tau蛋白磷酸化，结果显示，随着饥饿诱导自噬时间的延长，正常MEFs细胞中磷酸化tau水平逐渐降低；而Atg5-/- MEFs细胞中磷酸化tau蛋白的降解速度明显减慢(Fig3)。提示自噬参与磷酸化tau的降解。
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| Fig 2 Autophagy facilitates tau degradation in MEF cells A: Tau transfected MEF cells were starved in EBSS for the indicated times, and the levels of tau were blotted by tau-5 antibody; B: The quantitative data of the results in panel A. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. *P＜0.05, **P＜0.01 vs Atg5+/+ MEFs. |
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| Fig 3 Autophagy facilitates phosphorylated tau degradation in MEF cells A: Tau transfected MEF cells were grown for 24 hrs and treated with OA for 12 hrs, and then starved in EBSS for the indicated times, phosphorylated tau levels were blotted by AT-8 antibody; B: The quantitative data of the results in panel A. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments. *P＜0.05 vs Atg5+/+ MEFs. |
N2a细胞转染GFP-tau和RFP-Lamp1质粒，转染后24 h，加入OA诱导tau过度磷酸化，NH4Cl处理细胞6 h后观察细胞内tau和溶酶体的定位情况。结果显示，tau蛋白和Lamp1存在共定位，磷酸化tau形成的聚集体和Lamp1的共定位增加；提示tau和磷酸化tau能进入溶酶体降解(Fig4箭头所示)。
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| Fig 4 Colocalization of tau and lysosome in Neuro2A cells Neuro2A cells were transfected with GFP-tau and RFP-lamp1 plasmids. Twenty-four hours after transfection cells were treated or not with OA for 12 hrs, and then treated with NH4Cl for 6 hrs. The typical colocalization of tau and lysosome was indicated by arrows. Scale bar=5 μm. |
为了观察自噬 抑制对过度表达tau细胞形态的影响，我们同上转染N2a细胞，NH4Cl处理细胞6 h，用DAB结合免疫荧光染色法检测细胞形态以及tau和LC3的表达情况。结果发现，少量表达tau的细胞形态基本正常，细胞核完整(Fig5，细箭头所示)；而tau表达量多的 细胞胞体变圆，突起减少或消失(Fig5，粗箭头所示)；经NH4Cl处理后，细胞胞质中出现LC3点状聚集；表达tau细胞中tau形成聚集体，细胞核变小、致密或淡染、碎裂甚至消失(Fig5，空箭头所示)。提示自噬抑制能增加tau的细胞毒性。
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| Fig 5 Autophagy inhibition increases tau toxicity Neuro2A cells were transfected with tau, and then treated with NH4Cl for 6 hrs, cell morphology and LC3 expression were observed with DAB and immunofluorescence stain respectively. BF: Bright field. Scale bar=20 μm. |
正常tau蛋白是一种含磷蛋白质，每克分子tau蛋白中磷酸含量为2～3 mol。AD患者脑中tau蛋白发生过度磷酸化，每克分子tau中磷酸含量为5～9 mol。过度磷酸化tau蛋白聚集形成PHFs，除了失去促进微管组装的功能外，还能促使正常微管结构中已结合的tau蛋白解离出来，从而导致细胞骨架的崩解，引起神经元死亡。因此，PHF-tau组成的NFTs被认为是AD的病理性标志物之一，也广泛地存在于其他的神经退行性疾病中。Tau蛋白的磷酸 化水平受细胞内蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的双重调节，该平衡失调是tau发生异常磷酸化的主要原因。因此，任何引起蛋白激酶活性上调或磷酸酯酶活性下降的因素都可能导致tau的异常磷酸化。哺乳动物中磷酸酯酶主要有4种：PP-1、PP-2A、PP-2B和PP-2C。研究发现AD脑中PP-1、PP-2A等活性降低，对tau蛋白去磷酸化作用减弱，导致tau的磷酸化增加[12]。 OA是一种选择性蛋白磷酸酯酶PP1和PP2A的抑制剂，目前被广泛应用于诱导tau蛋白的过度磷酸化，模拟AD患者大脑中tau蛋白的异常磷酸化改变[12]。OA能导致Ser199、Ser202、Thr205、Ser396和Ser404等多个位点的磷酸化，其中，Ser202/Thr205位点过度磷酸化是tau蛋白病的共同特征，可在AD大脑NFTs中检测到[13]；因此，在本研究中我们用OA来诱导tau蛋白过度磷酸化，采用特异性识别Ser202/Thr205位点磷酸化tau蛋白的单克隆抗体AT-8来进行蛋白检测[11]。有研究发现Ser202/Thr205位点过度磷酸化能促进tau寡聚化，从而加剧神经退行性变的进程[14]，本研究中我们同样发现用OA诱导N2a细胞tau蛋白过度磷酸化后，高分子量的tau寡聚体增加。
为了探究自噬对细胞内tau和磷酸化tau水平的影响，我们采用溶酶体抑制剂或自噬激活剂处理N2a细胞，观察LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、p62以及tau蛋白表达变化。LC3是自噬体膜标志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种亚型；自噬形成时，胞质型LC3(即LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反映自噬水平的高低[15]。但在溶酶体功能抑制的情况下，LC3-Ⅱ自噬降解减少，同样会导致LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，因此我们同时检测了自噬底物蛋白p62的水平；p62能与泛素修饰的底物蛋白结合，并与自噬体膜上的LC3结合，从而介导泛素化底物和自身通过溶酶体降解，因此p62水平在一定程度上反映了细胞自噬活性[16]；我们的结果显示rapamycin处理的细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62水平降低；而NH4Cl处理的细胞，由于LC3-Ⅱ的溶酶体降解受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，同时p62水平增加，提示本实验中rapamycin和NH4Cl能有效调节自噬活性；在此基础上，我们首先观察了自噬对神经细胞内源性tau表达的影响，结果发现自噬激活或抑制对内源性tau水平无明显影响，提示自噬不参与神经细胞内源性tau降解。而在过表达tau的N2a细胞中，rapamycin能明显降低tau水平，尤其是减少磷酸化tau寡聚体水平；而NH4Cl处理后tau和磷酸化tau水平增加，提示自噬能降低过表达tau，尤其是磷酸化tau寡聚体水平。
通常情况下，细胞自噬的发生依赖于一系列自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)编码的蛋白，这些蛋白在自噬的不同阶段发挥着重要的作用。其中Atg5在细胞内形成Atg12-Atg5复合物，能促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变，对自噬体膜的延伸至关重要[17]。因此，Atg敲除通常代表细胞丧失自噬能力。Atg5基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(Atg5-/- MEFs细胞)作为特异性自噬缺失细胞，和野生型MEFs细胞一起作为研究对象，能更直观地反映自噬对tau降解的影响。因此，我们在饥饿诱导细胞自噬的基础上观察两种MEFs细胞中tau和磷酸化tau的降解情况，结果发现自噬缺失的细胞中tau和磷酸化tau降解速率明显降低，提示自噬能促进tau和磷酸化tau的降解。
溶酶体是细胞自噬的关键细胞器。细胞质中的蛋白质和细胞器最终在溶酶体降解。为了观察tau是否经过溶酶体途径降解，我们共转染GFP-tau和表达溶酶体相关膜蛋白的质粒RFP-Lamp1，结果发现tau和Lamp1在胞质内存在共定位，异常磷酸化tau形成的tau聚集体与溶酶体的共定位更明显，进一步证实tau和磷酸化tau通过溶酶体降解。另外，我们发现少量表达tau的细胞形态基本正常；而tau表达较多的细胞形态异常，胞体变圆，突起减少或消失，这与我们前期结果一致[18]；而自噬抑制能加重tau的毒性作用，表达tau细胞胞质内出现tau聚集体，细胞核分叶、固缩、碎裂或消失。
综上所述，细胞自噬参与过表达tau和异常磷酸化tau的降解，降低磷酸化tau寡聚体水平，而对内源性tau水平无明显影响；自噬抑制能增加tau的细胞毒性。至于自噬通路如何参与tau和磷酸化tau的降解过程，以及自噬减少tau寡聚体的具体机制还需进一步的研究。
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