经前期综合征(premenstrual syndrome,PMS)是指月经前周期性出现的精神和躯体症状群，影响妇女工作、学习、家庭、社会活动或人际关系等方面，肝气逆证则是PMS中一类以精神亢奋，急躁易怒为主要表现的常见亚型^[1]。前期临床调查发现PMS肝气逆证患者同时伴有如意识、记忆、学习等认知功能缺陷^{[2, 3]}，然而这方面实验工作不仅鲜有开展，且所得结果并不一致。近年来，国内外有关情绪和记忆的工作表明，情绪与认知相互作用、相互影响，且二者之间有共同的脑机制。关于情绪对记忆形成的作用、情绪影响记忆的途径以及参与情绪和记忆交互作用的脑区的探索越来越多，因此，我们推断PMS肝气逆证情绪异常可能会影响大鼠的学习记忆功能，而中药干预则可纠正模型大鼠学习记忆功能异常。为验证上述推断，本文应用择时分段造模法制备PMS肝气逆证大鼠模型，并采用旷场、水迷宫、物体识别和Y迷宫实验等行为学方法，系统评测模型大鼠情绪和学习记忆功能，以探查白香丹胶囊对模型大鼠学习记忆功能的调节作用。

SPF级 ♀ 健康未孕Wistar大鼠，体质量120~150 g，120只。由北京维通利华实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2007-0001。

生理盐水；无水乙醇；白香丹胶囊(由白芍提取物、香附挥发油和丹皮酚提取物配伍组成，青岛海川创新生物天然药物研究中心，批号：20071020)；氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司，批号H20050463)；ST-A数字脉冲生物刺激仪(济南空军后勤装配总厂、山东中医药大学联合研制)；Xmaze动物行为分析系统(XR-Xmaze，上海欣软信息科技有限公司)；大鼠旷场实验箱(XR-XZ301，上海欣软信息科技有限公司)；电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；OLYMPUS显微镜(CX21BIM-SET5，日本奥林巴斯公司)；Morris水迷宫(山东中医药大学脑行为学分析实验室自制)；Y迷宫(山东中医药大学脑行为学分析实验室自制)。

适应性饲养8 d，每日抓握所有大鼠，每只大鼠不得少于5 min，正常对照组大鼠的抓握过程贯穿整个实验。采用简易阴道涂片镜检法判定正常未孕大鼠的动情周期。阴道涂片每天1次，连续8 d。筛选动情周期规律大鼠48只进入实验。所有大鼠均饲养于恒温恒湿(22℃±3℃，0.60 RH±0.05 RH)、12/12 h明暗周期昼夜颠倒(20 ∶ 00开灯，8 ∶ 00关灯)环境中。所有实验操作均为暗淡灯光(<28 lx)下进行。

观测大鼠动情周期结束后，筛选出的48只大鼠行旷场实验，采集数据作为基线数据。将得分相近的大鼠随机分入以下4组中，每组12只：正常对照组(Control)、PMS肝气逆证造模组(Model)、白香丹干预组(BXD)、氟西汀干预组(FXT)。正常组大鼠与造模大鼠饲养条件及环境相同。

参照魏盛等^[4]报道方法予以改进。具体方法：将待造模的各组大鼠，置入可调式激惹、噪音、脉冲电刺激笼内，调整ST-A数字脉冲生物刺激仪条件：白天2 档(时间间隔5 min)，夜间3档(时间间隔10 min)，中等强度电流0.5 mA，电压2 700~3 300 V，脉宽0.3 s，晚间录像，每天观察记录大鼠各项体征。

动物按照药量/体质量比1 mL/100 g给药，各组大鼠于每日上午8 ∶ 30同时灌胃给药1次。氟西汀组大鼠造模刺激前给予氟西汀分散片灌胃，给药量为2.7 mg·kg^-1·d^-1；白香丹组大鼠造模刺激同时给予白香丹胶囊灌胃，给药量为0.2 g·kg^-1·d^-1；模型组与正常组给予等体积纯水。

采用旷场实验来评定大鼠应激后的行为变化，判断造模是否成功；采用 Morris水迷宫、Y 迷宫和新物体识别实验评价大鼠的空间学习记忆功能及非空间学习记忆功能。

于择时分段造模结束后进行。用Xmaze动物行为分析系统跟踪记录大鼠5 min内的行为表现。观察指标包括：①总路程；②中央区停留时间；③进入中央区次数。为避免气味干扰，每只大鼠测定后都应彻底打扫旷场箱，并用75%乙醇擦拭干净，吹干后再进行下一只检测。

参照文献操作方法^[7]加以改进，将大鼠置于Y迷宫任意一臂末端，任其自由探索8 min，摄像系统记录动物8 min的行为变化，记录以下各项指标：①总进臂次数：动物进入迷宫臂的次数(以大鼠4只脚均进入臂为进臂一次标准)；②轮流(交替)一次次数：依次连续进入Y迷宫全部3个臂一次的次数。③最大轮流次数：总进臂次数-2。自发轮流行为得分/%=总轮流次数/最大轮流次数×100%。

模型制备成功后次日进行水迷宫实验，测试大鼠的空间学习记忆能力。实验期间，为减少外界因素对大鼠行为的干扰，要尽量保持水温恒定，保证实验人员位置等外界实验环境的稳定性，采用Xmaze动物行为分析系统实时跟踪记录全过程。定位航行训练：每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中1次，每天训练2个时段，连续4 d，记录其寻找到水面下平台的时间(逃避潜伏期)及平台象限所停留的时间和路程等，若2 min内大鼠仍未找到平台，则将其置于平台停留20 s以形成记忆，逃避潜伏期记为2 min，检测大鼠的空间学习能力及记忆存储、巩固。空间探索测试：d 5撤去水下平台，任选一象限为入水点，将大鼠放入水迷宫中，记录大鼠2 min内的活动情况，分析大鼠的测试潜伏期、穿越平台次数及停留的时间、活动轨迹等指标，判断大鼠空间记忆存储和提取再现能力。

实验流程分为适应期、熟悉期和识别期3个过程。适应期：实验箱中不放任何物体，将大鼠放入其中，让其自由活动，计时3 min。熟悉期：实验箱中放入两个相同的物体(AA或BB)，距离两侧壁10 cm，并将大鼠于两物体等距离处放入，计时3 min。实验人员用秒表分别记录大鼠探索两物体的时间(以嘴靠近物体或鼻子正对物体约2 cm计为探索行为)，以秒表间断累积计时测定大鼠探索两物体的时间总和(s)，为d 3的计时提供练习。识别期：用两个物体A和B分别替换熟悉期的物体(AA或BB)，同样将大鼠置于两物体等距离处放入，实验人员分别记录3 min内各大鼠探索新、旧物体的时间总和(s)。测试期分辨指数(DI)来评价大鼠的物体非空间辨识能力，计算公式为：DI/%=T_F/(T_N+T_F) × 100 %，式中T_F为探索新物体所用的时间，T_N为探索旧物体所用的时间。

实验数据用Graphpad Prism5.0 统计作图软件分析，结果以表示，对实验不同 时期的多组比较采用two-way ANOVA分析，对造模后多个样本均数比较采用one-way ANOVA分析。

由Fig1可见，与正常组大鼠相比，模型组大鼠总路程明显增加(P<0.01)，进入中央区的次数及中央区停留时间明显减少(P<0.01)，表明模型组大鼠表现出明显焦虑样行为；白香丹组大鼠进入中央区次数明显减少(P<0.05)，其它参数差异均无显著性(P>0.05)；氟西汀组大鼠的所有参数差异均无显著性(P>0.05)。与模型组大鼠相比，白香丹组大鼠总路程明显降低(P<0.05)，中央区停留时间和进入中央区次数明显增多(P<0.05)，表明白香丹组大鼠焦虑样行为明显改善。氟西汀组大鼠的总路程明显降低(P<0.05)，其它参数差异均无显著性。

Fig 1 Result of open-field test of rats A:Total distance；B:Time spent in center；C:Number of crosses into center. *P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05 vs model.

图选项

由Fig2可见，各组大鼠Y迷宫空间工作记忆得分差异均无显著性(P>0.05)，表明PMS肝气逆证模型大鼠可能不存在空间工作记忆缺陷。

Fig 2 Y-maze test result of rats

图选项

由Fig3可见，与正常组相比，模型组的DI明显降低(P<0.01)，白香丹组和氟西汀组差异均无显著性。与模型组相比，白香丹组的DI明显升高(P<0.05)，氟西汀组则差异无显著性(P>0.05)。说明PMS肝气逆症对大鼠非空间学习记忆能力会造成一定的损伤；而给药干预后，大鼠DI较模型组大鼠明显上升，学习记忆能力得到改善。

Fig 3 Result of new-object recognition test of rats **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs model.

图选项

由Fig4可见，定位航行阶段，与正常组相比，模型组大鼠寻找平台时间均延长，且在d 2、4逃避潜伏期明显上升(P<0.05)；而与模型组相比，白香丹和氟西汀组大鼠寻找平台时间均缩短，且白香丹组和氟西汀组大鼠在d 2、4的逃避潜伏期明显降低(P<0.05)。空间探索阶段，与正常组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期明显上升(P<0.05)，而平台穿越次数明显减少(P<0.05)，白香丹组和氟西汀组差异均无显著性(P>0.05)；与模型组相比，白香丹组大鼠平台穿越次数明增多(P<0.05)，氟西汀组差异无显著性(P>0.05)。

Fig 4 Result of Morris water maze test of rats A:Escape latency of rats；B:Average latency of rats；C:Number of crossings of rats. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model.

图选项

旷场实验作为评价啮齿类实验动物运动功能和情绪状态的经典方法，已被广泛应用于精神神经药理学的各项工作中。由Fig1结果可见，与正常组相 比，模型组大鼠中央区停留时间及中央区进入次数 明显降低，具有明显的焦虑样行为，表明大鼠模型较好模拟了病证患者精神亢奋，急躁易怒样临床表现。给药干预后，白香丹组大鼠的中央区停留时间及中央区进入次数明显增加，焦虑样行为明显改善。而氟西汀组大鼠仅自主活动和探索水平明显下降，焦虑样行为改善作用不明显。以上结果表明择时分段刺激造模法能够成功制备PMS肝气逆证大鼠模型，给药干预后，白香丹胶囊能够有效缓解PMS肝气逆证模型大鼠的焦虑情绪，且作用优于氟西汀分散片。

经典Morris水迷宫测试包括定位航行和空间探索实验，主要用以考察动物训练后形成的稳定的空间位置认知^[10]，这种空间位置认知必须通过游泳和寻找水下平台才能得到强化，属于联合型学习中的操作式条件反射，平台的位置自身所处的位置无关，所形成的记忆是空间参考记忆。定位航行主要考察空间学习能力，即记忆的获得巩固，空间探索则考察提取再现空间参考记忆的能力，其存储信息的机制主要涉及海马、纹状体、基底前脑等边缘系统及大脑皮层相关脑区^{[11, 12]}。本文结果显示，定位航行实验中，与正常组相比，模型组大鼠逃避潜伏期延长，且d 2、4的逃避潜伏期明显升高，表明模型大鼠空间定位模糊，未能获得清晰的空间信息，有学习功能缺陷；而给予白香丹及氟西汀干预后，大鼠逃避潜伏期缩短，且两组大鼠在d 2、4都较模型组大鼠逃避潜伏期明显下降，表明白香丹和氟西汀能够提升大鼠对空间信息的获得能力，降低造模应激对大鼠学习功能的损伤。空间探索阶段，与正常组相比，模型组大鼠的平台穿越次数明显减少，测试期逃避潜伏期明显延长，说明模型组大鼠未能形成有效的空间记忆，存储提取记忆的能力受到损伤；而给药干预后，仅白香丹组大鼠平台穿越次数较模型组明显增加，测试期逃避潜伏期明显缩短，表明白香丹胶囊可能通过改善模型大鼠存储提取记忆的能力，从而降低造模应激对大鼠学习记忆能力的损伤。由上可见，造模应激不仅损伤大鼠学习能力(记忆的获得巩固)，而且影响大鼠记忆的提取重现能力；而白香丹胶囊可能是通过降低造模应激对以上两个过程的损伤，而有效纠正PMS肝气逆证模型大鼠空间学习记忆缺陷，且就该实验结果显示效果优于氟西汀分散片。

物体识别测试^[13]是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法，啮齿类动物能够区别不同于熟悉物体的新物体，可以分辨出旧物体的位置及物体出现的背景差别，新物体识别实验是海马依赖性任务之一^[14]。本文结果显示，模型组大鼠分辨指数较正常组大鼠明显下降，可见模型组大鼠并没有表现出对新物体喜好的特性，对旧物体并没有形成有效的记忆，这表明造模应激大鼠不仅影响学习能力，而且还影响记忆的存储和提取，从而造成PMS肝气逆证模型大鼠非空间学习记忆能力缺陷；而给药干预后，白香丹组大鼠分辨指数较模型组大鼠明显上升，且氟西汀组差异无显著性，可见白香丹胶囊不仅能够改善PMS肝气逆证模型大鼠非空间学习记忆能力，且效果优于氟西汀分散片。

Y迷宫主要用于研究啮齿类动物空间工作记忆^[15]，其完全是利用实验动物对新异环境探索的天性，由于动物每次转换探索方向时都需要记住前一次探索过的方向，因此Y型迷宫实验能够有效地测定动物的空间工作能力^{[16, 17]}。本文结果显示，各组大鼠间差异均无显著性，表明PMS肝气逆证模型大鼠可能不存在空间工作记忆缺陷。

本课题组前期工作证实，PMS肝气逆证可能与血液和大脑皮层中γ-氨基丁酸(GABA)的代谢紊乱有关，而白香丹胶囊通过增加GABA含量以及降低γ-氨基丁酸A受体(GABA_AR)β₂亚基蛋白表达水平从而抑制神经中枢发挥作用。由上可见，PMS存在学习记忆功能缺陷，且其学习和记忆过程均受损伤，即该病证患者记忆的形成、存储巩固以及提取再现能力均有一定程度的缺陷，但本研究中Y迷宫实验差异无显著性，表明PMS肝气逆证患者可能不存在空间工作记忆障碍，但也有临床研究结果显示其存在缺陷，究其原因，是否是空间工作记忆障碍仅适用于PMS其他亚型患者，目前尚不清楚，这值得我们深入探索。应用白香丹胶囊干预后，模型大鼠的空间学习记忆能力和非空间学习记忆能力得到明显的改善，表明白香丹胶囊不仅能够降低模型大鼠焦虑状态，还能改善模型大鼠的学习记忆能力。