帕金森病(PD)的主要病变是脑部黑质含黑色素的神经元大量死亡，以致纹状体内神经递质多巴胺(DA)减少。酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺合成代谢的限速酶，胶质源性神经营养因子(GDNF)对DA能神经元具有特异性营养作用，在纹状体同时导入TH和GDNF基因并且能被调控表达是PD基因治疗的理想方法^{[1, 2]}。用于调控哺乳动物细胞基因表达的Tet-On系统虽表现出很好应用前景，如诱导剂强力霉素(Dox)高效、无毒，在时间上准确调控外源基因表达等 ^[2]，但亦有不足，主要体现在相对高的基础活动 ^{[3, 4, 5, 6]}。Tet-On系统由两部分组成，四环素调控的反式作用子(rtTA)与四环素应答元件(TRE)。研究表明，Tet-On系统缺陷与rtTA结构不完善^{[3, 4, 5, 6]}以及TRE启动子人巨细胞病毒最小启动子(PminCMV)自身激活^{[3, 7]}有关。在前期实验里，我们采用改良Tet-On修饰的慢病毒载体系统，即rtTA2s-M2^{[4, 8]}替代rtTA；小鼠白蛋白启动子 (Palb)^[3] 替代PminCMV，把TH和GDNF双治疗基因通过一个内部核糖体进入位点(IRES)构建于Palb的下游，获得重组慢病毒穿梭质粒pRRL-Palb-TH- IRES-GDNF，并包装成重组慢病毒Lv-TH-GDNF ^[1]。在本实验里，我们用获取的Lv-TH-GDNF与rtTA2s-M2病毒感染HeLa细胞，以及行PD大鼠纹状体内直接转移，拟通过体内、体外实验观察Dox对Lv-TH-GDNF目的基因的调控表达以及Lv-TH-GDNF对PD模型大鼠的治疗效应。

Lv-TH-GDNF慢病毒(滴度：2.1×10¹¹ TU·L^-1)、rtTA2s-M2病毒(滴度：2.01×10¹¹ TU·L^-1)、HeLa细胞(均本实验组提供)；6-羟基多巴胺(6-OHDA)、维生素C、阿扑吗啡(APO)、多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、兔抗大鼠TH单克隆抗体(Sigma公司)；兔抗大鼠 GAPDH单克隆抗体、羊抗大鼠GDNF单克隆抗体(Abcam公司)；SP免疫组化二抗试剂盒-通用型(上海麦约尔生物技术有限公司)；其他均为进口或国产试剂。

SD大鼠，♂，体质量250~280 g，由福建医科大学实验动物中心提供。

分组：HeLa 组、HeLa+Lv-TH-GDNF组、HeLa+Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2组、HeLa+Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+Dox(5 mg·L^-1)组。HeLa细胞以1× 10⁵接种于6孔板，用高糖DMEM完全培养液培养。HeLa细胞组加入新鲜培养液。病毒组是将各病毒以20的MOI值感染HeLa细胞，12 h后更换新鲜培养液。病毒+Dox组是病毒感染48 h后加入Dox (5 mg·L^-1)，继续孵育48 h，收集细胞用于免疫印迹法测定TH、GDNF基因表达。

收集各组细胞，加入细胞裂解液抽提蛋白，按照实验操作说明分别进行蛋白定量、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜、封闭。随后免疫反应中一抗分别用兔抗大鼠TH单克隆抗体(工作浓度1 ∶ 1 000)或羊抗大鼠GDNF单克隆抗体(工作浓度1 ∶ 250)，对照用兔抗大鼠GAPDH 单克隆抗体(工作浓度1 ∶ 250)。与二抗杂交、洗膜等操作后，将膜与化学发光底物室温孵育，曝光胶片，显影定影。

将6-OHDA 8 μg(溶于0.2%抗坏血酸的生理盐水，4 g·L^-1)注射到SD大鼠右侧内侧前脑束(MFB)。MFB坐标^[9]AP：-4.3mm，ML：-1.5 mm，DV：-7.5 mm。注射速度1 μL·min^-1，注射完毕留针2 min后缓慢退针，缝合皮肤，腹腔注射青霉素(0.5毫升/只)。手术第4周用APO(0.5mg·kg^-1)皮下注射测转，>5圈/分钟为模型成功。

选取造模成功的SD大鼠52只，随机分成病毒+Dox组13只、病毒组13只、PBS对照组13只和健康对照组13只。成功造模的第5周，病毒组每只动物右侧纹状体同时注射等量的Lv-TH-GDNF、rtTA2s-M2病毒(各2 μL)，饮清水。病毒+Dox组接受同等量的病毒注射，给予含强力霉素(0.2 g·L^-1)和蔗糖(40 g·L^-1)的饮用水。PBS对照组接受等体积的 PBS注射，饮清水。健康对照组不做注射，饮清水。纹状体注射部位的坐标：AP:+1.0 mm，ML: -3.0 mm，DV: -5.5 mm。病毒注射后4周，每组大鼠行APO诱发旋转行为观察。病毒注射后6周，每组取5只大鼠行黑质TH免疫组化；每组取5只大鼠行右侧纹状体单胺类神经递质DA、DOPAC含量的检测；每组取3只大鼠的右侧纹状体，通过免疫印迹法检测GDNF和TH基因表达。

APO(溶于0.1%抗坏血酸的生理盐水)以0.5 mg·kg^-1皮下注射诱发大鼠旋转，用旋转行为测试系统记录。

用免疫组化方法。动物灌注固定，大脑行腹侧中脑黑质冠状系列冰冻切片，30 μm厚，收集黑质切片于PBS缓冲液。方法按照SP免疫组化二抗试剂盒-通用型说明进行。每张切片的一抗为兔抗大鼠 TH单克隆抗体(工作浓度1 ∶ 1 000)，阴性对照组以PBS缓冲液代替一抗)，常规脱水、透明、封片、镜检。计算损伤侧与健侧的黑质致密部(SNpc)TH阳性细胞数的百分比。

用高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)测定。大鼠断头取脑，冰上分离右侧纹状体，称重后置-70℃冰箱备用。检测标本处理方法参照文献^[10]。色谱条件：Hypersil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm id)，保护柱(10 mm×4.6 mm id)，工作电极为玻璃碳电极，参比电极Ag/AgCl，电化学监测器设定电压为+650 mV。流动相为缓冲液(0.02 mol·L^-1柠檬酸三钠和0.05 mol·L^-1磷酸氢二钠) ∶ 甲醇=90 ∶ 10，流速为1.0 mL·min^-1。实验常温进行。以标准品保留时间作为定性指标。

用免疫印迹法测定。大鼠断头取脑，在移植区注射点附近取100 mg的纹状体加入全细胞裂解液匀浆，蛋白定量。取40 μg总蛋白上样，具体见方法1.3.2。用Quantity One软件进行灰度分析。

实验数据以表示，采用SPSS 11.5统计软件做t检验。

病毒感染HeLa细胞实验，免疫印迹法检测结果(Fig1)：Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带，阴性各组未见目的蛋白条带。

Fig 1 TH and GDNF protein in HeLa cells examined by Western blot 1：HeLa group; 2：HeLa+Lv-TH-GDNF group; 3：HeLa+Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2 group; 4：HeLa+Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+Dox(5 mg·L-1)group. GAPDH：intrinsic control.

图选项

Fig 2 Time course of experiment

图选项

完全损毁PD大鼠模型，观察到动物少食少动、尾部强直，有时有自发性旋转。在病毒或PBS移植注射后4周，APO能诱导PD模型大鼠向左旋转(Fig3)。记录大鼠60 min平均旋转次数，实验组与各自移植前相比，或者移植后与PBS对照组相比，仅病毒+Dox组均明显降低(P<0.01)。

Fig 3 Cumulative apomorphine-induced contralateral rotations(n=13) **P<0.01 vs PBS-treated groups; △△P<0.01 vs pre-treated group

图选项

移植后6周，黑质TH免疫组化图片显示：TH阳性细胞被染成棕褐色，PBS对照组损伤侧的TH阳性细胞变性、消失，数目明显少于健侧(Fig4)。计算损伤侧与健侧SNpc的TH阳性细胞数的百分比(Fig5)，与健康对照组比较，各实验组均明显下降(P<0.01)；在PD模型鼠中,与PBS对照组比较，仅病毒+Dox组明显升高(P<0.01)。

Fig 4 Photomicrographs of TH immunohistochemistry in SN A~B：Photomicrographs of TH-positive cells in intact-side(A)or lesion-side(B) SNpc of a PBS-treated rat(×200); C：The SN of a non-injected-treated rat(×10); D：The SN of a PBS-treated rat(×10).

图选项

Fig 5 Number of TH-positive cells in SNpc(n=5) **P<0.01 vs PBS-treated groups; △△P<0.01 vs non-injected-treated groups

图选项

移植后6周，HPLC-ECD检测结果(Fig6)：与健康对照组比较，各实验组损伤侧纹状体DA、DOPAC含量明显降低(P<0.01)。在PD模型鼠中，与PBS对照组比较，仅病毒+Dox组数值明显升高(P<0.01)。单位以每g脑组织湿重所含单胺类递质质量mg表示。

Fig 6 Content of DA and DOPAC in lesion-side striatum measured by HPLC-ECD(n=5) A：DA;B：DOPAC. **P<0.01 vs PBS-treated groups;△△P<0.01 vs non-injected-treated groups

图选项

根据纹状体移植区TH、GDNF免疫印迹结果及灰度表明(Fig7)，在PD模型鼠中，与PBS对照组比较，TH、GDNF蛋白量在病毒+Dox组均明显增高(P<0.01)，而病毒组差异无显著性(P>0.05)。

Fig 7 Expression of TH and GDNF genes of tissue near injection site in striatum analyzed by Western blot 1：Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2-treated groups; 2：PBS-treated groups; 3：Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+Dox-treated groups. GAPDH：intrinsic control.

图选项

Tet-On系统是在1995年Gossen等^[11]成功构建，专被用于调控哺乳动物细胞的基因表达。其rtTA由反式四环素阻遏蛋白(rtetR)与单纯疱疹病毒的VP16 转录活化域融合而成，其TRE由四环素操纵序列(TetO)与下游的人PminCMV融合而成。但该系统存在不足，首先是诱导基因的不稳定表达^{[4, 5]}。其次，系统激活效率较低^{[4, 5, 12]}。最后是系统最显著的缺陷：相对高的基础活动^{[3, 4, 5, 6]}，即诱导剂不存在时，rtTA也会与TRE结构中TetO结合，诱导外源基因转录。研究表明，系统缺陷与rtTA结构不完善^{[3, 4, 5, 6]}以及PminCMV自身激活^{[3, 7]}有关。rtTA结构不完善主要体现为VP16的毒性作用干扰压制细胞的正常转录活动^{[3, 4]}；结构中的原核密码子、隐性剪接供体和受体位点可能造成其在真核细胞翻译成无活性蛋白，二者都将导致系统诱导基因不稳定性表达^{[4, 5]} 。2000年Urlinger等^[4]在rtTA基础上构建一个新型Tet-On反式激活因子rtTA2s-M2。Urlinger等通过改造rTetR的结构以及VP16转录活化域，降低了VP16毒性，提高系统诱导基因表达的稳定性、对Dox的敏感性以及明显的低背景活动。此外，为了降低Tet-On系统的背景活动，Zabala等^[3]用一个片段为196bp的肝特异性表达的小鼠Palb做为TRE的启动子，背景效应也明显下降。

在前期实验中，我们获得改良Tet-On系统修饰的Lv-TH-GDNF和rtTA2s-M2病毒。在本次实验里，Lv-TH-GDNF与rtTA2s-M2病毒以相同 MOI值感染HeLa细胞，免疫印迹显示，仅Dox阳性组可见GDNF、TH蛋白条带，阴性组未见(如Dox不存在或者只有慢病毒 Lv-TH-GDNF单独感染细胞)，说明改良Tet-On系统能调控目的基因表达，在离体细胞实验未见基础活动。

在整体实验，我们建立完全损毁PD大鼠模型，该模型90%的黑质多巴胺能神经元和纹状体纤维受损^[9]，我们将Lv-TH-GDNF与rtTA2s-M2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体，用Dox诱导TH、GDNF基因表达。移植后4周，在PD模型鼠中，通过与PBS对照组比较，我们观察到仅有病毒+Dox组大鼠，APO诱导旋转行为能得到明显改善(P<0.01)。与此一致，移植后6周，病毒+Dox组大鼠损伤侧(移植侧)黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量均明显增加(P<0.01)，说明在Dox诱导下Lv-TH-GDNF能减缓6-OHDA诱导DA能神经元的变性。随后，我们通过免疫印迹法检测纹状体移植区TH、GDNF基因表达，结果显示，与PBS对照组相比，病毒+Dox组TH、GDNF的蛋白量均明显增高(P<0.01)，说明移植是成功的，在Dox诱导下，rtTA2s-M2与Lv-TH-GDNF结构中的TRE结合，激活TRE启动子Palb，使外源基因GDNF和TH表达。由于Tet-On系统最显著的缺陷是相对高的基础活动，我们根据以往研究结果^{[13, 14]}：单侧黑质纹状体TH阳性细胞或DA含量丢失达90%以上，才出现药物诱发的不对称行为。结合本实验采用的PD大鼠模型，有90%的黑质多巴胺能神经元和纹状体纤维受损，而在病毒移植后，与PBS对照组相比，无诱导剂的病毒组APO诱发的旋转行为无改善、移植区纹状体TH、GDNF蛋白量均无明显增加的实验结果，我们虽不能肯定改良的Tet-On系统调控的基因表达在体内不存在基础活动，但可以推测这种基础活动是极其微弱的。

综上所述，新型Tet-On修饰Lv-TH-GDNF纹状体内直接转移，在Dox诱导下对PD大鼠有一定治疗作用，且目的基因表达在体外不存在基础活动。