2. 河北医科大学第三医院肾内科, 河北 石家庄 050051;
3. 河北医科大学病理教研室, 河北 石家庄 050017
2. Dept of Nephrology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, China;
3. Dept of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
已发现肾素-血管紧张素系统(renin angioten-sin system,RAS)在多种肾脏疾病肾组织中被激活[1]。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作为RAS系统的主要效应因子，在肾组织内常明显升高，可以通过多种途径造成足细胞损伤，导致肾小球硬化，加速肾脏疾病的进展[2, 3]。近年来发现，Notch通路在多种肾脏疾病足细胞中被激活，Notch受体释放出其活化形式NICD进入细胞核内，调控其下游基因Hes，参与肾小球足细胞损伤[4]。Nephrin是重要的足细胞特异蛋白，表达在裂孔隔膜上，其表达量的改变与足细胞损伤程度密切相关。已有研究发现在糖尿病小鼠模型和高糖培养的足细胞中，Notch通路对Nephrin表达起调控作用，但AngⅡ对足细胞Notch通路活化及Nephrin表达的影响还不清楚[5]。本研究通过体外AngⅡ刺激小鼠足细胞，观察其对Notch1、NICD1、Hes1和Nephrin表达的影响，并给予血管紧张素Ⅱ 1受体阻断剂(angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonism,AT1Ra)缬沙坦干预，以证实AngⅡ对Notch信号通路活化及Nephrin表达的影响。
1 材料与方法 1.1 材料条件永生性小鼠足细胞购自北京协和细胞中心。小鼠γ-干扰素购自Peprotech公司。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品。AngⅡ购自Sigma公司。兔抗β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司。兔抗NICD1、Hes1和Hey1多克隆抗体购自Abcam公司。Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司。缬沙坦为北京诺华公司产品。
1.2 细胞培养及分组小鼠足细胞在33℃ CO2培养箱中，以含有10%胎牛血清及10 000 U·L-1 γ-干扰素的RPMI 1640培养液培养细胞使其增殖，传代后更换不含γ-干扰素的RPMI 1640培养液，在37℃ CO2培养箱中培养10~14 d促进分化。同步化24 h后，AngⅡ(10-6 mol·L-1)刺激0、12、24、48、72 h后收集细胞进行相关指标检测。随后在AngⅡ刺激的同时加入缬沙坦(10-6 mol·L-1)给予干预。
1.3 免疫荧光化学检测Nephrin蛋白表达细胞于75%乙醇室温固定30 min，0.3% Triton X-100 37℃打孔15 min。加入正常山羊血清，37℃、30 min封闭内源性生物素，弃血清，加入Nephrin多克隆抗体，4℃过夜。滴加FITC标记的荧光二抗，37℃避光孵育1 h，荧光显微镜下观察结果。以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。
1.4 Western blot检测Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin蛋白表达用RIPA裂解液(含1×PBS、1%NP-40、0.5%去氧胆酸钠、0.1% SDS，用前加PMSF 0.1 g·L-1)提取细胞总蛋白，取30 μg样品SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin、β-actin多克隆抗体4℃孵育过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记IgG二抗，37℃孵育2 h，暗室中显影，底片经扫描仪透扫后凝胶分析软件分析结果。与β-actin光密度的比值分别表示其相对表达量。
1.5 Real-time PCR检测Notch1、Hes1、Nephrin mRNA表达TRIzol 提取细胞总RNA。反转录反应体系总体积为20 μL，按照反转录说明书合成cDNA。引物分别为：18S，上游5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′，下游5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′；Notch1，上游5′-GTGGATGACCTAGGCAAGTCG-3′，下游5′-GTCTCCTCCTTGTTGTTCTGCA-3′；Hes1，上游5′-CACGACACCGGACAAACCA-3′，下游5′-GCCGGGAGCTATCTTTCTTAAGTG-3′；Nephrin，上游5′-TACCACCAGCATTTCCACG-3′，下游5′-GGGCTCGGCTGTATGTATT-3′，均由北京奥科公司合成。PCR反应体系总体积为50 μL，扩增条件为94℃预变性2 min，94℃变性25 s，60℃退火30 s，40个循环结束。由PCR反应曲线得到Ct值，采用2-△△Ct法计算相对定量结果。
1.6 统计学处理所有数据均用
表示，各组间数据比较采用方差分析，数据统计应用SPSS 10.0统计软件完成。
Western blot检测显示：AngⅡ呈时间依赖性刺激Notch1、NICD1、Hes1蛋白表达增加(P<0.01)，其中Notch1蛋白在AngⅡ刺激12 h开始增加，24 h达到最高点，48 h和72 h相对24 h稍有下降(P<0.05)，但仍高于AngⅡ刺激0 h；NICD1和Hes1蛋白表达最高点都在12 h，24、48、72 h相对24 h表达下降(P<0.05或P<0.01)，NICD1蛋白在AngⅡ刺激72 h表达仍高于0 h(P<0.01)，Hes1蛋白在AngⅡ刺激72 h与0 h表达无明显差异(P>0.05)；AngⅡ呈时间依赖性抑制Nephrin蛋白表达，表达最低点在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig1)。Real-time PCR检测显示：Notch1 mRNA在AngⅡ刺激12 h增加，24 h表达最强(P<0.01)，72 h相对24 h表达有所下降(P<0.05)，但仍高于0 h(P<0.01)；Hes1 mRNA在AngⅡ刺激12 h表达最强(P<0.01)，随着刺激时间的延长表达降低(P<0.01)，在AngⅡ刺激72 h与0 h表达无明显差异(P>0.05)；AngⅡ呈时间依赖性抑制Nephrin mRNA表达，表达最低点在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig2)。
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| Fig 1 Expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by Western blot **P<0.01 vs AngⅡ 0 h; △P<0.05 vs AngⅡ 24 h; #P<0.05, ##P<0.01 vs AngⅡ 12 h |
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| Fig 2 Expression of Notch1, Hes1 and Nephrin mRNA in AngⅡ-stimulated podocyte by Real-time PCR **P<0.01 vs AngⅡ 0 h; △P<0.05 vs AngⅡ 24 h; ##P<0.01 vs AngⅡ 12 h |
免疫荧光化学显示，Nephrin在足细胞胞质表达，AngⅡ刺激12 h时表达较0 h时减少，缬沙坦可增加Nephrin在AngⅡ刺激后的表达(Fig3)。与AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h时Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表达增加(P<0.01)，缬沙坦可减少AngⅡ刺激12 h时Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表达(P<0.01)；与AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h时Nephrin蛋白及mRNA表达降低，缬沙坦可增加AngⅡ刺激12 h时Nephrin蛋白及mRNA表达(P<0.01)(Fig4、5)。
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| Fig 3 Effect of valsartan on expression of Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by immunofluorescence A:0 h; B:12 h; C:12 h+valsartan |
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| Fig 4 Effect of valsartan on expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by Western blot **P<0.01 vs AngⅡ 0 h; ##P<0.01 vs AngⅡ 12 h |
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| Fig 5 Effect of valsartan on expression of Notch1, Hes1 and Nephrin mRNA in AngⅡ-stimulated podocyte by Real-time PCR **P<0.01 vs AngⅡ 0 h; ##P<0.01 vs AngⅡ 12 h |
AngⅡ在多种肾脏疾病肾组织内常明显升高，通过血流动力学及非血流动力学因素，对足细胞产生损伤，引起足细胞固有蛋白表达减少，破坏滤过膜，导致发生蛋白尿、肾小球硬化、最终引起肾功能衰竭[2]。本实验发现，AngⅡ刺激小鼠足细胞后，可使Notch通路受体Notch1、活化形式NICD1及其下游基因Hes1表达增加，表达强度最强时间点在24 h和12 h，随后，随着AngⅡ刺激时间的延长表达降低，说明AngⅡ可以在较短的时间内就激活足细胞Notch信号通路。AngⅡ刺激足细胞Notch1受体表达增加并向细胞内释放出NICD1，NICD1进入细胞核内调控Hes1表达，进而参与足细胞损伤过程。Ozasa 等[6]用AngⅡ刺激血管平滑肌细胞后，发现AngⅡ通过激活Notch通路促进细胞增殖和迁移。You等[7]发现阻断AngⅡ作用后，可通过抑制Notch通路活化，减轻因持续血压负荷引起的心室肥大、功能失常。
Nephrin是重要的裂孔膜蛋白，当足细胞受到损伤时，Nephrin表达降低造成裂孔膜结构破坏，功能丧失，影响肾小球滤过功能，产生大量蛋白尿[8]。AngⅡ刺激足细胞后，发现Nephrin表达明显降低，说明AngⅡ可通过降低足细胞特异蛋白，引起足细胞损伤。缬沙坦是当今临床上常用的治疗肾脏疾病的AT1Ra类药物，研究发现其对肾脏的保护作用，不仅仅取决于降低血压的作用[9]。本研究发现，在AngⅡ刺激的小鼠足细胞中给予缬沙坦后，抑制Notch通路的活化，进而增加足细胞Nephrin蛋白及mRNA的表达，说明AngⅡ在足细胞可能通过Notch通路调控Nephrin表达，缬沙坦能抑制Notch通路，减少足细胞损伤过程，从而达到对肾脏疾病的治疗作用。
总之，AngⅡ可激活足细胞Notch通路，抑制Nephrin表达。缬沙坦能抑制AngⅡ对Notch通路的活化，增加Nephrin表达，达到治疗肾脏疾病的作用。
| [1] | Shao J Q, Iwashita N, Du H, et al. Angiotensin Ⅱ receptor blocker provides pancreatic beta-cell protection independent of blood pressure lowering in diabetic db/db mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28(10):246-57. |
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| [3] | 曹延萍, 王 建, 李 航, 等. 氯沙坦抑制内质网特有凋亡途径在糖尿病大鼠肾脏中的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(9):1165-8. Cao Y P, Wang J, Li H, et al. Protective effect of losartan on the kidney of diabetic rats by inhibition of endoplasmic reticulum-specific apoptosis pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010, 26(9):1165-8. |
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