肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全球每年有138万肺癌新增病例和超过100多万人死于肺癌，其中，非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%~85%，其5年生存率不到15%[1]。NSCLC患者中，约30%的患者在诊断时就已发生远处转移，50%~60%的患者在治疗过程中发生远处转移，并且最终80%~90%的患者都死于肺癌的转移[2]。因此，抑制和预防肺癌细胞转移是治疗NSCLC和提高患者生存率的关键。肿瘤转移受多因素、多步骤调控，主要包括肿瘤细胞间黏附力降低，而与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)黏附力增强、降解ECM和基底膜、肿瘤细胞迁移、侵袭能力的增强，从而进入血流或淋巴系统，最终到达靶器官形成新的肿瘤生长[3]。因此，抑制NSCLC细胞黏附、侵袭和迁移是抑制其转移的基础。中药桔梗在临床上常用于治疗肺部和呼吸系统疾病，桔梗皂苷-D(platycodin-D，PD)是从其中分离提取的一种三萜类单体，它是桔梗抗癌的主要有效成分。近年国内外的研究发现，PD对肺癌、胃癌、乳腺癌和人白血病等多种肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用[4, 5]。此外,在PD抑制肿瘤转移方面，研究仅发现PD单独或联合蛇床子对乳腺癌侵袭和迁移具有抑制作用[5, 6]，然而，其对NSCLC侵袭和迁移的研究尚未开展。本实验旨在探究PD对两种NSCLC细胞肺大细胞肺癌H460和肺腺癌细胞A549黏附、侵袭和迁移能力的影响及其作用机制，为PD抑制NSCLC转移提供实验基础和依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药品与试剂桔梗皂苷-D，分子量1224.58，上海源叶生物科技有限公司，批号：20110402。该化合物最初溶于二甲亚砜(DMSO)，为使用前的原液(DMSO的最终浓度小于0.01％)。RPMI 1640和DMEM/F12培养液：HyClone,USA；胎牛血清：Gibco,USA；磷酸缓冲盐(PBS)：Solarbio；胰酶、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、牛血清蛋白(BSA)、凝胶试剂盒：碧云天；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)：Millipore，Germany；Transwell小室：Corning，USA；抗体均为美国Cell Signaling公司；TRIzol: Invitrogen，America；cDNA第一链合成试剂盒：Fermentas，Lithuania；Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) ：Toyobo，Japan。
1.1.2 仪器CO2细胞培养箱 (日本SANYO公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；自动酶标仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；倒置荧光相差显微镜、荧光显微镜、图像获取系统(日本Olympus公司)；荧光定量PCR循环仪(中国中山达安)；核酸电泳仪(中国北京六一)；PCR循环仪、高速低温离心机(美国Labnet公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.1.3 细胞株肺腺癌A549细胞和肺大细胞肺癌H460细胞，购自中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将A549细胞培养于含10%胎牛血清DMEM/F12培养液中；将H460细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。置37℃、体积分数为 5%的 CO2培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。
1.2.2 细胞黏附实验96孔培养板包被：每孔加入CollagenⅠ溶液50 μL，置37℃、5% CO2孵箱孵育1 h；PBS洗2次，加入3% BSA 0.2 mL，孵育2 h，PBS再洗2次，备用。分别取不同浓度PD(0、5、10、20、30 μmol·L-1)作用24 h后的H460和A549细胞，经洗涤、消化后用含10%胎牛血清DMEM液稀释，调整细胞浓度为8×108·L-1，分别加入到包被过的96孔板，每孔100 μL，每组设5个平行复孔，37℃、5% CO2条件下温育2 h。温育结束后弃去各孔培养液，PBS冲洗，除去未黏附细胞，每孔加50 μL MTT使用液(PBS溶解，1×103 mg·L-1)，细胞培养箱温育3 h。吸弃MTT使用液，每孔加DMSO 150 μL，溶解结晶后，酶标仪测波长570 nm下各孔OD值。以PD(0 μmol·L-1)组为空白对照组，黏附抑制率=(1-实验组OD值 / 对照组OD值)×100%。
1.2.3 划痕实验取对数生长期的H460和A549细胞，按每孔 1×106个接种于6孔板中，待细胞贴壁长到 90%时，用20 μL移液器枪头在每孔的中间垂直划线。然后用PBS洗涤3次，去除掉落的细胞，加入PD (0、30 μmol·L-1)处理后，置37℃、5%的 CO2培养箱中继续培养。于镜下观察PD作用0、6、12、24、48 h后划痕宽度变化并拍照(×100),每组实验重复 3 次。分别计算3条平行划痕的平均宽度(每条划痕各取3个固定位置计算宽度)。划痕愈合率/%=(初始划痕宽度-指定时间的划痕宽度)/ 初始划痕宽度×100%。
1.2.4 Transwell小室侵袭实验Transwell小室含有基质，胶纤维膜孔径为8 μm，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，上室加入100 μL不含胎牛血清的培养液，然后按照1×108·L-1在上室加入PD(0、10、 20、30 μmol·L-1)处理后的细胞悬液30 μL，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养72 h，取出滤膜，甲醇固定，姬姆萨染色，显微镜下每张滤膜随机取5个视野(×200)，计数穿膜细胞数，取平均数表示每种肿瘤细胞的侵袭能力。
1.2.5 RT-PCR采用TRIzol细胞裂解法提取组织RNA，测定样品RNA在波长260和280 nm处的吸光度比值，检测其纯度和浓度。设计并合成扩增引物序列及PCR产物大小：Human-GAPDH primer (132 bp),Sense primer: 5′-ATCGTGGAAGGACTCA-3′，Antisense primer: 5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′；Human-MMP2 primer (146 bp)，Sense primer:5′-CTACTGAGTGGCCGTGTTTG-3′，Antisense primer: 5′-GGAAGCTCTGACCTTTCCAG-3′；Human-MMP9 primer (136 bp)，Sense primer: 5′-TCTTCCAAGGCCAATCCTAC-3′，Antisense primer: 5′-ATCACCGTCGAGTCAGCTC-3′。cDNA合成条件：取2 μg提取RNA,加入20 μL的反应体系中，PCR扩增条件：逆转录产物用无核酸酶的水稀释10倍，取20 μL用于扩增，95℃ 5 min，94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s，共40个循环；每秒升高0.1℃直至升高到95℃停止。取10 μL PCR产物经2%琼脂糖电泳鉴定，缓冲液冷却循环器凝胶图像分析系统摄片，并分析其光密度，结果以目的基因与内参基因(Human-GAPDH)吸光度的比值2-ΔΔCT表示。
1.2.6 Western blot 检测细胞内相关蛋白变化取对数生长期的细胞消化接种到6孔板中，细胞密度为5×108·L-1，药物处理一定时间后，收集细胞PBS洗涤2次，每孔加入细胞裂解液200 μL，1200 r·min-1离心20 min。蛋白定量：取蛋白，加入4×上样缓冲液，100℃下变性5 min。15％的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后依次加入第一、二抗体，在室温下孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min，滴加ECL发光试剂，于凝胶成像系统曝光。
1.2.7 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学处理。对计量资料,所得数据用
表示,样本均数比较采用Student′s t-test检验或单因素方差分析(one way ANOVA)。
不同浓度的 PD(0、5、10、 20、30 μmol·L-1)分别作用 H460和A549细胞 24 h 后[PD(0 μmol·L-1)组为空白对照组]，采用细胞黏附实验检测细胞黏附能力。结果表明，PD 作用后，H460和A549细胞黏附能力都逐渐减弱，即细胞黏附抑制率皆逐渐升高，并呈浓度依赖性(Tab1)，与PD(5 μmol·L-1)组的细胞黏附抑制率相比，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。
采用划痕实验检测PD对H460和A549细胞迁移能力的影响。如Fig1所示，PD(30 μmol·L-1)分别作用H460和A549细胞0、6、12、24、48 h后，划痕宽度逐渐增大，划痕两侧的细胞密度逐渐减少；相反，H460和A549细胞的空白对照组(Control)生长0、6、12、24、48 h后，划痕宽度逐渐减小，划痕两侧的细胞密度逐渐增大。同时，两种细胞的Control组划痕愈合率逐渐增大，PD(30 μmol·L-1)作用组逐渐减小，并且与同一作用时间的Control组相比，差异有统计学意义( P<0.01),见Tab2。
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| Fig 1 Effects of PD on cell migration ability of H460 and A549 cells(n=3) |
Transwell小室侵袭实验检测PD对H460和A549细胞侵袭能力的改变，结果发现，PD(10、20、30 μmol·L-1)作用 24 h 后，H460和A549细胞的处理组穿过微孔滤膜的细胞数明显低于对照组(P<0.01)，并呈浓度依赖性(Fig2)。
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Fig 2
Effects of PD on cell invasion ability in H460 and A549 cells(, n=3)
**P<0.01 vs control
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利用RT-PCR进一步研究PD对H460和A549细胞中与癌细胞黏附、侵袭和迁移密切相关的金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA水平的调控。如Tab3所示，PD有效抑制了H460和A549细胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表达，并随PD浓度增加抑制作用增强，与Control组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
为进一步探究PD抑制H460和A549细胞黏附、迁移和侵袭的作用机制，本实验利用Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果表明，与PD抑制了H460和A549细胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表达相一致，PD下调MMP-2和MMP-9蛋白表达，并且呈浓度和时间依赖性(Fig3)。同时，进一步探测PD抑制 MMP-2和MMP-9蛋白后，其上游ERK信号通路中Ras、p-c-Raf和p-ERK 1/2以及 p-Akt表达变化。如Fig3所示，PD分别作用H460和A549细胞后，细胞中Ras、p-c-Raf、p-ERK 1/2和 p-Akt蛋白表达水平降低，表明PD抑制ERK信号通路和p-Akt的表达，并且呈浓度和时间依赖性。
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| Fig 3 Regulation of expression levels of MMP-2/9, upstream related proteins of ERK signaling pathway and p-Akt induced by PD in H460(A) and A549(B) cells(n=3) **P<0.01 vs control |
NSCLC占肺癌的80%～85%，具有低生存率、高转移率的特点，并且80%～90%的NSCLC患者死亡和复发是由转移引起的。桔梗入药始载于《神农本草经》，味苦、辛，性平，归肺经，临床上以桔梗为主药组成方剂治疗急性上呼吸道感染、肺脓疡、肺脓肿、肺癌和纵隔肿瘤等肺部疾病，均取得较好的疗效[7]。PD是从中药桔梗中分离提取的一种三萜类单体，是桔梗抗癌作用的有效成分，其对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。在抑制肿瘤转移方面，现仅有文献报道PD具有抑制乳腺癌侵袭和迁移作用，PD对肺癌转移的影响及其机制研究尚未开展。
肿瘤转移是多基因、多因素、多步骤的生物学行为。降低癌细胞与ECM间黏附力是癌细胞转移的开始，本实验首先由细胞黏附实验探究PD作用后H460和A549细胞与ECM蛋白CollagenⅠ黏附能力的改变，结果表明PD降低两种细胞黏附能力，并呈浓度依赖性。癌细胞与ECM黏附后，侵袭ECM和基底膜，分泌多种蛋白水解酶，降解ECM和基底膜，使细胞穿越破损的基底膜脱离、迁离原发灶，进而随血液或淋巴循环发生肿瘤转移[8]。因此，降低癌细胞侵袭和迁移能力是抑制肿瘤转移的关键。本实验通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验发现，PD有效抑制H460和A549细胞迁移和侵袭。
ECM和基底膜的改变是肿瘤浸润转移的重要环节。Ⅳ型胶原纤维是ECM和基底膜的重要组分之一，金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9能有效地将其降解[9]。研究证实，MMP-2和MMP-9不仅可以降解ECM和基底膜，参与肿瘤黏附、侵袭和血管的侵入，而且与原发及转移瘤的生长、肿瘤的血管生成及肿瘤恶变有关[10]。此外，在多种具有侵袭性和高转移肿瘤中都发现有MMP-2和MMP-9的表达增高。目前，研究表明MMP-2和MMP-9的表达水平与肺癌的分期、转移和预后密切相关[11]。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表达是抑制NSCLC侵袭和迁移的关键。采用RT-PCR 和Western blot研究发现，PD作用H460和A549细胞后，不仅在基因水平降低细胞中MMP-9 和 MMP-2 mRNA的表达，而且在蛋白质的水平下调H460和A549细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达，并呈时间和浓度依赖性。因此，PD抑制NSCLC细胞黏附、侵袭和迁移与抑制MMP-2和MMP-9的表达有关。
大量研究证明，MMP-9和MMP-2的表达主要受上游丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(MAPKs)信号通路的调控。激活MAPKs通路可上调MMP-2和MMP-9的表达，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，反之，则抑制肿瘤侵袭转移[12] 。MAPKs信号通路主要包括细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路、p38 MAPK通路和c-Jun-N端激酶(JNK)通路。并且，ERK信号通路即Ras/Raf/ERK信号通路在许多肿瘤的增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡过程中起主要作用[13]。本实验通过对Ras/Raf/ERK信号通路进一步研究发现，PD可下调H460和A549细胞中Ras、p-c-Raf和p-ERK 1/2的表达，并呈浓度和时间依赖性。因此，PD抑制MMP-9和MMP-2表达可能与抑制其上游ERK信号通路有关。
此外，Akt通过激活MMP-9和MMP-2促进肿瘤的侵袭和迁移[13, 14]。因此，抑制Akt的表达被作为抑制肿瘤转移的调控靶点。并且研究发现，Akt的激活即形成磷酸化的Akt(p-Akt)与NSCLC的转移密切相关，p-Akt的过表达可以提高NSCLC黏附、侵袭和转移能力[15]。本实验研究表明，PD抑制H460和A549细胞中p-Akt的表达，并且呈浓度和时间依赖性。
综上，本实验结果首次证明了PD抑制NSCLC细胞H460和A549细胞黏附、侵袭和迁移，其作用与下调MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达及抑制其上游ERK信号通路和p-Akt表达有关。由此表明，PD具有较好的抗NSCLC转移作用，为PD的进一步药物研发和临床应用提供了实验基础和依据。然而，PD抑制MMP-2和MMP-9表达上游多个信号通路调控，和信号中的关键靶蛋白及其对应的靶基因，有待通过靶蛋白抑制剂和siRNA沉默干扰技术深入研究，并且亟需通过体内实验进一步验证PD抑制NSCLC转移的作用。
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