再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信号通路是抗心肌缺血/再灌注损伤的主要机制，该信号通路主要包括促生存激酶磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，两者均为丝氨酸/苏氨酸激酶。很多实验已表明PI3K和ERK1/2磷酸化参与缺血预适应及药物介导的抗心肌缺血/再灌注损伤过程[1, 2]。前者激活后能够促进下游靶蛋白内皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)、p70S6K、GSK-3β的磷酸化，从而抑制mPTP的开放而发挥保护作用[3]； ERK1/2信号通路激活能够抑制蛋白酶caspase-3的激活，从而抑制心肌细胞凋亡。两条信号通路的激活均能够抑制促凋亡蛋白Bim、Bax、Bad的表达，从而使缺血心肌细胞免于坏死或凋亡[4]。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是细胞神经鞘磷脂代谢产物之一[5]。本实验室前期研究发现，S1P后适应抑制炎症反应、拮抗氧化应激、保护线粒体结构功能，减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤，亦可缓解心肌细胞缺氧/复氧损伤[6, 7]。上述作用是否与RISK通路有关，需进一步的实验加以验证。本实验拟观察S1P后适应对RISK通路中关键成分Akt和ERK1/2磷酸化的影响，以及PI3K/Akt抑制剂LY294002、ERK1/2抑制剂PD98059对S1P后适应保护作用的影响，以明确S1P后适应保护作用与RISK通路的相关性。
1 材料H9c2 心肌细胞株(中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心)；S1P(批号：032M4103V)、PI3K/Akt抑制剂(LY294002，LY)(批号：092M4616V)、ERK1/2抑制剂(PD98059，PD)(批号：MFCD00671789)均购自美国Sigma公司；Fura-3/AM(江苏碧云天生物技术研究所，批号：20140113)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(北京嘉美生物公司，批号：4AD271211F)；anti-p-Akt(ser473)(美国Santa Cruz Biotechnology公司，批号：20131210)；anti-Akt(美国Cell Signaling Technology公司，批号：20120319)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(批号：970380)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(批号：107724)均购自北京中衫金桥生物技术有限公司； Olympus CK2 型倒置显微镜(日本Olympus公司)；Model 680 型酶标仪(美国BIO-RAD 公司)；缺氧箱(美国Billups-rothenberg 公司)；FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD 公司)；FV1000型激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。
2 方法 2.1 细胞分组将培养的大鼠H9c2细胞随机分为7组，即(1)正常(C)组：细胞在5% CO2、37℃培养箱中培养；(2)缺氧/复氧(H/R)组：细胞缺氧16 h后换用无血清的DMEM复氧培养4 h；(3)S1P组：缺氧处理16 h后，复氧前加入终浓度为4 μmol·L-1的S1P；(4)S1P+LY294002(S1P+LY)组：在复氧前加入终浓度为10 μmol·L-1的LY，处理30 min后加入S1P；(5)LY294002(LY)组：复氧前加入终浓度为10 μmol·L-1的LY；(6)S1P+PD98059(S1P+PD)组：在复氧前加入终浓度为50 μmol·L-1的PD，处理30 min后加入S1P；(7)PD98059(PD)组：复氧前加入终浓度为50 μmol·L-1的PD。
2.2 模型的建立将H9c2 心肌细胞用模拟缺氧液置换正常培养液，用95% N2+5% CO2 的混合气于37℃培养箱缺氧培养16 h；再换用含药DMEM低糖培养基在95% O2+5% CO2的正常培养条件下培养4 h，建立H/R损伤模型。
2.3 测定指标 2.3.1 细胞存活率正常组正常培养，其他组细胞经缺氧16 h 以及复氧4 h处理后，利用MTT法测定490 nm波长下每孔光吸收度值(OD 值)，并按下述公式计算各组细胞存活率：细胞存活率/%=(各实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100 %。
2.3.2 MDA 含量、SOD 活性的检测造模给药处理后收集上清液，按MDA、SOD 试剂盒说明操作，比色法测定各组细胞培养液MDA 含量及SOD 活性。
2.3.3 心肌细胞内钙离子测定造模给药处理后弃培养液，用PBS 冲洗2遍。加入500 μL含5 μmol·L-1 Fluo-3 AM的PBS，37℃避光下负载40 min。PBS洗涤细胞后，避光孵育20 min。激光共聚焦显微镜下测定各组的荧光强度(激发波长：488 nm，发射波长：525 nm)，用Image Pro Plus软件处理分析、计算各组的荧光强度。
2.3.4 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡百分率经处理后消化法收集细胞，采用Annexin V/PI 双染法对凋亡细胞进行染色，流式细胞仪测定荧光强度，并以Expo32软件处理分析、计算凋亡率。
2.3.5 心肌细胞Western blot 检测经处理后裂解细胞，BCA 法蛋白定量，将蛋白样本进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电转膜法将胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭液室温封闭1 h，分别加入p-Akt、t-Akt、p-ERK 1/2、t- ERK 1/2一抗，4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，加入ECL发光液1 min 显色。经显影、定影后测定特异性条带光密度值，并计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值。
2.4 统计学处理计量资料以
表示，采用SPSS 16.0软件对数据进行处理，各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。方差齐时，多组间比较用LSD法、SNK法；方差不齐时，采用Dunnett T3法。
H/R组细胞存活率明显低于正常对照组(P<0.01)。经S1P后处理后，S1P组细胞存活率明显高于H/R组(P<0.01)。与S1P组相比，加入LY294002 或PD98059以后细胞存活率明显降低，且与H/R组相比差异无显著性，见Tab1。
, n=6)
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与正常对照组相比，H/R组MDA含量明显升高(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明显降低(P<0.01)；经S1P后处理后，S1P组的MDA含量明显降低(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明显提高(P<0.01)；与S1P组相比，加入LY294002或PD98059以后，MDA含量明显增加(P<0.01)，T-SOD、 Mn-SOD活力明显降低(P<0.01)，且与H/R组相比差异无显著性，见Tab1。
3.3 细胞内游离钙离子的测定结果显示，经过H/R损伤后，细胞内钙离子的荧光强度明显增强，与正常对照组相比，差异有显著性(P<0.01)；经过S1P处理后，细胞内钙离子的荧光强度明显降低，且与H/R组相比，差异有显著性(P<0.01)；加入LY294002以后，细胞内钙离子的荧光强度明显增强，且与S1P组相比，差异有显著性(P<0.01)。加入PD98059以后，细胞内钙离子的荧光强度明显增强，且与S1P组相比，差异有显著性(P<0.01)，见Tab2及Fig1。
, n=3)
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| Fig 1 Effect of S1P, LY and PD on fluorescence intensity of intracellurar Ca2+ of H/R injury H9c2 cells by laser scanning confocal microscope A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group |
测定结果表明，正常对照组细胞凋亡比较少，与正常对照组相比，H/R组细胞凋亡明显增加(P<0.01)；经过S1P处理后的细胞凋亡率与H/R组相比明显下降(P<0.01)；与S1P组相比，加入LY294002以后，细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，加入PD985059以后，细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，见Tab3及Fig2。
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| Fig 2 Effect of S1P, LY and PD on the apoptotic rate of H9c2 cells after H/R injury(n=3) A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group |
Western blot结果显示，各组之间t-Akt蛋白、t-ERK1/2蛋白表达差异无显著性。与正常对照组相比，H/R处理能使p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表达明显增加(P<0.01)；与H/R组相比，S1P组能明显增加p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01)；与S1P组相比，加入LY294002以后，p-Akt蛋白的表达明显降低(P<0.01)，加入PD90589以后p-ERK1/2蛋白的表达明显降低(P<0.01)，且与正常对照组相比均无明显变化。见Fig3、4。
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| Fig 3 Effect of S1P and LY on the expression of p-Akt/t-Akt after H/R in H9c2 cells(n=6) **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs H/R group; ▲▲P<0.01 vs S1P group |
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| Fig 4 Effect of S1P and PD on the expression of p-ERK1/2/t- ERK1/2 after H/R in H9c2 cells(n=6) *P<0.05,**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs H/R group; ▲▲P<0.01 vs S1P group |
有研究表明，心肌缺血/再灌注损伤涉及多方面因素，如氧自由基生成增多、细胞内钙离子超载、线粒体损伤等[8]。当氧自由基的生成超过了机体内源性抗氧化系统的清除能力时，过多的氧自由基可引起脂质过氧化反应，并刺激线粒体细胞色素C的释放，后者可进一步激活caspase-9，诱导细胞凋亡。SOD是机体重要的内源性自由基清除剂，主要包括分布于线粒体的Mn-SOD以及分布于胞质的Cu/Zn-SOD，其活性的高低可间接反映机体消除ROS的能力 [9]。MDA是脂质过氧化的产物，测试MDA的含量不仅可以反映心肌细胞膜结构的脂质过氧化程度，而且可间接反映氧自由基水平及氧化应激损伤的程度[10]。本实验发现，H/R组氧自由基增多，抗氧化能力减弱，细胞内钙离子增加，细胞凋亡率提高；而给予S1P能减轻细胞脂质过氧化损伤、提高细胞的抗氧化能力、减轻细胞内钙离子超载、抑制细胞凋亡。
RISK信号通路主要包括PI3K/Akt及ERK通路。PI3K/Akt通路广泛存在于细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路。ERK在正常心肌细胞中低表达，当受到I/R或者H/R的刺激时，ERK被激活并表达上调[11]。近年来研究显示，ERK信号通路在心肌I/R或者H/R中主要是发挥保护作用[12]。作为心肌保护重要的信号传导机制，很多研究已证实RISK信号通路在缺血预适应或后适应抗心肌缺血/再灌注损伤中的作用[12]。也有研究报道，药理性后适应(如七氟醚、阿片受体激动剂等)可通过激动PI3K-Akt或ERK1/2发挥心肌保护作用[13, 14]。然而，离体心脏灌流实验研究报道，S1P受体激动剂FTY720k可激活Akt，促进LVDP恢复，但并没有缓解心肌损害，减少梗死面积[15]。本研究发现，S1P在保护缺氧/复氧损伤心肌细胞的同时，亦可提高p-Akt和p-ERK1/2水平，而应用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路或者PD98059阻断ERK1/2信号通路，均可明显抑制S1P对心肌细胞的保护作用，表现为细胞存活率下降，MDA含量增加，细胞培养液中T-SOD和Mn-SOD的活性降低，细胞内钙离子的浓度增加，细胞凋亡率增加。
综上所述，S1P对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤的保护作用与激活RISK信号通路有关。关于S1P对其通路上下游蛋白的影响，本实验未进行验证，仍需进一步的研究。
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