杜仲提取物中五个成分血浆蛋白结合率的测定

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曹旭, 谢玉敏, 朱迪, 陈鹏程, 巩仔鹏, 王爱民. 杜仲提取物中五个成分血浆蛋白结合率的测定[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(1): 131-135 复制到剪切板

CAO Xu, XIE Yu-min, ZHU Di, CHEN Peng-cheng, GONG Zi-peng, WANG Ai-min. Determination of plasma protein binding rate of five components in Eucommia ulmoides extract[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2015, 31(1): 131-135. 复制到剪切板

杜仲提取物中五个成分血浆蛋白结合率的测定

曹旭¹, 谢玉敏¹, 朱迪¹, 陈鹏程¹, 巩仔鹏¹, 王爱民²

1. 贵阳医学院药学院贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004
2. 贵阳医学院民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004

收稿日期:2014-09-24,修回日期:2014-10-29

基金项目：贵州省科技重大专项项目(黔科合重大专项字[2012]6009号);贵州省中药现代化研究开发专项(黔科合中药字[2013]5062号，黔科合重G字[2013]4001号);贵州省高等学校创新能力提升计划(黔教合协同创新字[2013]04)

作者简介: 曹旭(1991-)，女，硕士生，研究方向：中药药效物质基础及质量控制，Tel:0851-6908468，E-mail:1406391764@qq.com
王爱民(1962-)，男，学士，教授，研究方向：中药药效物质基础及质量控制研究，通讯作者,Tel:0851-6908468，E-mail: gywam100@gmail.com

摘要：目的测定杜仲药材中5个成分的血浆蛋白结合率。方法采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率，生物样本用甲醇沉淀蛋白进行处理，以葛根素为内标，利用超高效液相色谱-串联质谱仪测定血浆和缓冲溶液中的5个成分浓度。结果在所研究浓度范围内，京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷的平均蛋白结合率分别为(25.77±2.68)%、(57.54±3.79)%、(53.91±3.00)%、(24.15±4.92)%、(49.78±3.61)%。结论京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷的蛋白结合率较低，原儿茶酸、绿原酸和松脂醇单葡萄糖苷则与大鼠血浆蛋白有中等强度的结合。

关键词：杜仲京尼平苷酸原儿茶酸绿原酸松脂醇二葡萄糖苷松脂醇单葡萄糖苷平衡透析法液质联用

Determination of plasma protein binding rate of five components in Eucommia ulmoides extract

CAO Xu¹, XIE Yu-min¹, ZHU Di¹, CHEN Peng-cheng¹, GONG Zi-peng¹, WANG Ai-min²

1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China
2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM (Ministry of Education), Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China

Abstract:Aim To determine the plasma protein binding rate of five components of Eucommia ulmoides extract. Methods The equilibrium dialysis method was used to study the plasma protein binding rate. The plasma samples were extracted by protein precipitation with methanol. With the use of puerarin as the internal standard, UPLC-MS/MS was carried out to determine the concentration of the five compounds in and out of the dialysis membrane. Results The average plasma protein binding rates of five compounds on the area of the concentration which was determinate were as follows, respectively: geniposidic acid was (25.77±2.68)%, protocatechuic acid was (57.54±3.79)%, chlorogenic acid was (53.91±3.00)%, pinoresinol diglucoside was (24.15±4.92)%, and pinoresinol singleglucoside was (49.78±3.61)%. Conclusions The results show that the binding percentage of geniposidic acid and pinoresinol diglucoside is relatively low, but the binding rate of the others with rat plasma protein is moderate.

Key words: Eucommia ulmoides geniposidic acid protocatechuic acid chlorogenic acid pinoresinol diglucoside pinoresinol singleglucoside equilibrium dialysis method UPLC-MS/MS

杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver的干燥树皮，又名思仙、思仲、木棉，为我国名贵滋补药材，主要分布于四川、贵州、广西、云南等地。杜仲具有补肝肾、强筋骨、降血压、抗肿瘤等诸多功效^{[1, 2]}。目前研究表明，杜仲主要功效成分为环烯醚萜类、木质素类、黄酮类、苯丙素类等，其中京尼平苷酸具有降血压、抗肿瘤、抗氧化等药理作用，原儿茶酸具有抗氧化作用，绿原酸具有抗菌的作用，松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇单葡萄糖苷则为主要降血压成分^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}。药物血浆蛋白结合率是进行药动学研究的重要参数^{[9, 10, 11]}，目前仅报道了松脂醇二葡萄糖苷和京尼平苷酸药物动力学研究^{[12, 13]}，对于杜仲中多种成分血浆蛋白结合率的研究尚未见报道。本文以京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、原儿茶酸和绿原酸为检测指标，采用平衡透析法研究其在大鼠血浆中的药物蛋白结合率，为进一步研究杜仲的药动学提供基础参数。

1 仪器与材料 1.1 仪器

超高效液相色谱ACQUITY UPLC系统(美国Waters公司)，配有二元超高压溶剂系统、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1质谱工作站；涡旋混合器ZH-2(天津药典标准仪器厂)；冷冻高速离心机Allegra 64R(美国Beckman Coulter 公司)；氮吹仪MTN-2800D(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；电子天平EL204(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；透析袋MD25(截留相对分子质量 8000-14000，塞兰博生物制品有限公司)。

1.2 试剂与试药

京尼平苷酸和原儿茶酸对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号120314、110306，纯度≥98%)；绿原酸对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号MUST-11042802，纯度≥98%)；松脂醇二葡萄糖苷对照品(上海顺勃生物工程有限公司，批号201206，纯度≥98%)；松脂醇单葡萄糖苷对照品(江苏弘惠医药有限公司，批号070801，纯度≥98%)；葛根素对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号111-090623，纯度≥98%)。杜仲提取物(自制，各指标成分含量：京尼平苷酸3.5%、原儿茶酸0.17%、绿原酸0.19%、松脂醇二葡萄糖苷2.1%、松脂醇单葡萄糖苷1.0%)。乙腈、甲酸为色谱纯，实验用水为超纯水，其他试剂为分析纯。

1.3 动物

健康SD大鼠，♂，体质量为240~260 g，由贵阳医学院实验动物中心提供(批号SCXK[黔]2014-0001)。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱Waters BEH C₁₈(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱，流动相：0.1%甲酸乙腈(A)，0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱程序见Tab1，流速：0.35 mL·min^-1，柱温：45 ℃，进样器的温度：15 ℃，进样体积为1 μL。

Table 1 Table of gradient elution

Time/min	A/%	B/%	curve
Initial	5	95	-
0.5	10	90	6
3.5	20	80	6
4	90	10	6
5	5	95	1

表选项

2.2 质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3 kV，离子源温度120 ℃，喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气流速650 L·h^-1，去溶剂气温度350 ℃，反吹气流速为50 L·h^-1，碰撞气为氩气，碰撞气流速0.16 mL·min^-1，扫描方式为多反应离子监测(MRM)；负离子模式(ESI^-)，用于定量的离子对(m/z)京尼平苷酸：373.2→211.0，原儿茶酸：152.9→109.0，绿原酸353.1→191.0，松脂醇二葡萄糖苷：681.3→357.2，松脂醇单葡萄糖苷：519.3→357.2；正离子模式(ESI⁺)，葛根素(内标)：417.0→267.0；锥孔电压为35V，碰撞能量分别为15、15、15、25、15、35V。

2.3 溶液的配置 2.3.1 标准溶液和内标的配制

精密称取京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷对照品适量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容。得京尼平苷酸(1.350 g·L^-1)、原儿茶酸(0.974 g·L^-1)、绿原酸(1.000 g·L^-1)、松脂醇二葡萄糖苷(1.004 g·L^-1)、松脂醇单葡萄糖苷(1.010 g·L^-1)的储备液。分别精密量取京尼平苷酸等5种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液。精密称取0.00500 g葛根素对照品至5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得葛根素(1.000 g·L^-1) 的储备液。取内标储备液适量至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 mg·L^-1的内标溶液，置冰箱(-20 ℃)保存，备用。

2.3.2 磷酸缓冲液(PBS)的配制

精密称取KH₂PO₄ 0.2 g、Na₂HPO₄ 2.88 g、KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g，用适量超纯水溶解，加1% NaOH调节pH至7.4，将溶液转移至1 000 mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，储存备用。

2.4 样品处理方法 2.4.1 血浆样品处理方法

精密量取大鼠血浆500 μL，置于5 mL离心管中，补加甲醇50 μL，依次加入1%甲酸水200 μL，内标溶液(20 mg·L^-1)10 μL，甲醇2 mL，涡混1 min，超声5 min，4 ℃、15 000 r·min^-1离心10 min，取上清液置离心管中，氮吹仪45 ℃空气吹干，甲醇300 μL复溶，15 000 r·min^-1离心10 min后取上清液UPLC-MS/MS进样分析。

2.4.2 缓冲液样品处理方法

精密量取缓冲液1 mL，置于2 mL离心管中，补加 50 μL甲醇，依次加入1%甲酸水200 μL，内标溶液10 μL，涡混1 min，氮吹仪45 ℃空气吹干，甲醇300 μL复溶，15 000 r·min^-1离心10 min,取上清液UPLC-MS/MS进样分析。

2.5 方法学验证 2.5.1 专属性考察

分别精密量取空白血浆500 μL或空白磷酸缓冲液1 mL，除不加内标外，其余按“2.4”项操作，获得空白样品色谱图A；将一定浓度标准溶液和内标溶液加入空白血浆或磷酸缓冲液，同上操作得色谱图B；取平衡透析实验血浆或缓冲液，同上操作得色谱图C，相关色谱图见Fig1。京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷及内标葛根素的相对保留时间分别为0.97、1.06、1.45、2.37、3.69和1.80 min，内源性物质对待测物的测定无干扰。

Fig 1 HPLC chromatograms of five analytes and internal standard in plasma A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with reference substance and internal standard; C: Plasma samples. 1: Geniposidic acid; 2: Protocatechuic acid; 3: Chlorogenic acid; 4: Puerarin; 5: Pinoresinol diglucoside; 6: Pinoresinol singleglucoside

图选项

2.5.2 标准曲线的制备

分别取6份空白血浆或磷酸缓冲液，依次加入含有5个指标成分的混合标准溶液50 μL，配制成相应质量浓度的标准溶液，按“2.4”项下操作。以样品的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标Y，样品浓度为横坐标X，用加权最小二乘法进行线性回归，权重系数为1/C，求得标准曲线，见Tab2。结果表明，在测定范围内线性关系良好。

Table 2 Standard curves of five analytes in plasma and buffer solution

Analyte		Concentration range/mg·L^-1	Curvilinear equation	r	LLOD/ μg·L^-1
Geniposidic acid	plasma	0.077~18. 4	Y=0.5081X +0.0087	0.9997	7.30
	dialysate		Y=0.6367X +0.0123	0.9998	6.99
Protocatechuic acid	plasma	0.025~6.012	Y=1.0830X+ 0.0019	0.9998	2.15
	dialysate		Y=1.4711X +0.0067	0.9998	1.53
Chlorogenic acid	plasma	0.026~6.198	Y=0.9422X +0.0019	0.9996	3.98
	dialysate		Y=1.8178X +0.0013	0.9997	3.37
Pinoresinol diglucoside	plasma	0.152~37.037	Y=0.8143X+ 0.0062	0.9997	14.8
	dialysate		Y=1.1756X +0.0094	0.9996	13.6
Pinoresinol singleglucoside	plasma	0.077~18. 4	Y=2.5185X +0.0045	0.9998	3.16
	dialysate		Y=3.3595X +0.0013	0.9998	2.19

表选项

2.5.3 准确度和精密度

按“ 2.5.2 ”项下分别配制含有京尼平苷酸等5个指标成分的血浆或磷酸缓冲液低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，按“2.4”项下操作，连续测定3 d，每个浓度平行5份。考察方法的准确度与日内、日间精密度。结果表明该方法准确、可靠、重现性好(Tab3、4)。

Table 3 Accuracy, precision and recovery of five compounds in plasma

Analyte	Control/ mg·L^-1	Extraction recovery/%	Accuracy/%	Precision (RSD/%)
Analyte	Control/ mg·L^-1	Extraction recovery/%	Accuracy/%	Intra-day	Inter-day
Geniposidic acid	0.077	109.05±9.97	102.58±2.45	2.38	0.32
	0.693	97.85±4.23	102.68±2.59	2.52	0.83
	6.283	101.84±3.94	99.02±2.73	2.76	0.73
Protocatechuic acid	0.025	98.50±7.17	105.23±5.10	4.85	0.13
	0.223	103.15±0.84	104.90±6.38	6.08	2.86
	2.004	92.19±7.65	100.77±7.90	7.84	1.78
Chlorogenic acid	0.026	99.08±2.86	100.66±6.36	6.32	2.98
	0.230	103.08±10.54	107.80±5.04	4.68	3.55
	2.066	100.98±10.14	104.15±7.39	7.10	2.37
Pinoresinol diglucoside	0.152	108.69±0.69	99.66±3.13	3.14	5.00
	1.372	102.76±2.87	100.59±8.44	8.39	3.54
	12.346	95.77±9.33	97.76±4.89	5.00	1.37
Pinoresinol singleglucoside	0.077	103.33±1.86	103.93±4.84	4.66	4.47
	0.693	100.93±4.28	104.24±3.65	3.50	0.53
	6.235	100.71±3.81	101.15±3.16	3.12	0.51

表选项

Table 4 Accuracy, precision and recovery of five compounds in buffer solution

Analyte	Control/ mg·L^-1	Extraction recovery/%	Accuracy/%	Precision (RSD/%)
Analyte	Control/ mg·L^-1	Extraction recovery/%	Accuracy/%	Intra-day	Inter-day
Geniposidic acid	0.077	102.93±2.90	100.62±4.25	4.22	0.54
	0.693	99.61±7.01	101.24±3.41	3.36	1.37
	6.283	98.87±8.	97.48±2.95	3.02	2.66
Protocatechuic acid	0.025	91.91±11.42	94.37±6.05	6.42	3.10
	0.223	91.85±8.75	103.33±9.97	9.65	2.32
	2.004	110.46±4.01	108.65±7.69	7.07	2.95
Chlorogenic acid	0.026	83.54±0.87	93.69±6.49	6.93	7.46
	0.230	85.24±6.08	94.90±5.07	5.34	1.69
	2.066	103.93±1.42	102.61±3.88	3.78	0.79
Pinoresinol diglucoside	0.152	92.81±7.55	95.27±4.29	4.50	2.07
	1.372	103.44±5.63	107.32±9.42	8.78	1.19
	12.346	97.85±6.06	100.44±1.61	1.60	2.13
Pinoresinol singleglucoside	0.077	96.32±4.33	97.73±5.50	5.63	1.67
	0.693	98.92±5.76	100.09±2.67	2.67	0.75
	6.235	99.21±7.32	99.92±3.79	3.79	0.62

表选项

2.5.4 提取回收率

按“2.5.2”项下分别配制血浆或磷酸缓冲液低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，每个浓度平行5份，按“2.4”项下操作，记录各物质峰面积(A_提取)。另取低、中、高浓度的混合标准溶液，吹干，残留物以300 μL甲醇溶解，记录各物质峰面积(A)。将两组峰面积进行比较，即A_提取/A计算各物质的提取回收率，结果见Tab3、4。

2.5.5 稳定性考察

按“ 2.5.2 ”项下分别配制血浆或磷酸缓冲液低、中、高3个浓度的质控(QC)样品，每个浓度平行5份，分别考察在室温放置4 h，4℃下冷藏6 h，反复冻融3次，及处理后自动进样器中放置24 h后的稳定性，结果表明，在上述条件下的RSD均小于10%，样品稳定性良好。

2.6 血浆蛋白结合率实验方法

将透析袋剪成4cm 左右的小段，用蒸馏水煮沸5 min，再用60 ℃蒸馏水冲洗2 min。取出少量缓冲液冲洗后，于缓冲液中浸泡，4 ℃保存备用。将处理后的透析袋一端折叠用线结扎，将1 mL空白血浆加入透析袋内，放一粒玻璃珠以保证透析袋在缓冲液中保持垂直，透析袋内留一小空气泡，将透析袋另一端扎紧，使其悬浮于盛有20 mL缓冲液的广口瓶中，膜外缓冲液中杜仲提取物浓度分别为5、10、25、50、100、200 mg·L^-1，调节透析袋内外液面，使其保持在同一水平面，并避免透析袋贴于瓶壁。将瓶口密封后，于4℃静置72 h至药物扩散平衡。透析结束后，用10%的高氯酸溶液检查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者则该样品作废。分别测定透析袋内药物浓度Dt (总浓度)与袋外药物浓度Df (游离药物浓度)，根据公式计算血浆蛋白结合率：血浆蛋白结合率/%=[(Dt-Df)/Dt]×100%，结果见Tab5。

Table 5 Protein binding rate of five compounds in plasma of rats( n =6)

Analyte	Control/ mg·L^-1	Drug concentration/mg·L^-1		Protein binding rate/%	Average/%
Analyte	Control/ mg·L^-1	Plasma in bag filter	Dialysate out of bag filter	Protein binding rate/%	Average/%
Geniposidic acid	5	0.280±0.016	0.206±0.015	25.55±1.80	25.60±2.50
	10	0.587±0.076	0.434±0.057	26.03±3.55
	25	1.122±0.060	0.831±0.057	25.94±3.74
	50	2.203±0.074	1.637±0.072	25.67±2.09
	100	4.482±0.225	3.346±0.174	25.33±2.49
	200	8.395±0.549	6.286±0.257	25.12±1.85
Protocatechuic acid	5	0.043±0.001	0.018±0.002	58.98±5.36	57.58±3.73
	10	0.086±0.008	0.036±0.002	57.98±2.09
	25	0.157±0.014	0.066±0.005	57.66±5.69
	50	0.316±0.034	0.133±0.011	57.75±2.20
	100	0.590±0.035	0.252±0.016	57.23±1.82
	200	0.969±0.054	0.424±0.037	56.16±4.46
Chlorogenic acid	5	0.043±0.003	0.019±0.002	54.98±1.88	54.28±3.19
	10	0.108±0.003	0.050±0.002	54.72±3.57
	25	0.199±0.017	0.090±0.004	54.42±3.92
	50	0.421±0.035	0.191±0.014	54.42±3.65
	100	0.954±0.071	0.438±0.016	53.94±3.62
	200	1. 3±0.067	0.793±0.050	53.39±3.21
Pinoresinol diglucoside	5	0.140±0.007	0.105±0.009	24.74±5.94	24.01±4.71
	10	0.337±0.023	0.253±0.016	24.61±5.82
	25	0.652±0.033	0.490±0.012	24.65±4.65
	50	1.300±0.055	0.986±0.044	24.07±3.82
	100	2.608±0.189	1.984±0.044	23.59±5.44
	200	4.723±0.194	3.650±0.159	22.61±4.59
Pinoresinol singleglucoside	5	0.114±0.004	0.056±0.003	50.51±2.75	49.99±3.42
	10	0.279±0.028	0.138±0.008	50.40±3.27
	25	0.544±0.026	0.269±0.012	50.49±3.90
	50	1.081±0.084	0.539±0.024	50.02±3.31
	100	2.103±0.219	1.049±0.043	49.66±5.57
	200	3.460±0.180	1.760±0.036	49.04±1.85

表选项

3 讨论

药物经吸收进入血液后，一部分与血浆中的蛋白结合，一部分呈游离的分子状态。平衡透析法基于药物结合的平衡原理，可测定药物游离浓度，是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。

本实验建立了使用UPLC-MS/MS测定杜仲提取物大鼠血浆蛋白结合率的实验方法，实验证明此方法可快速、准确地同时测定杜仲提取物中的5个指标成分。实验中对药液浓度、平衡时间进行了考察，在4 ℃条件下，平衡24、48、72、96 h后分别测定透析袋内外浓度，最终选择72 h为平衡时间。血浆蛋白结合率实验结果提示，杜仲提取物中除京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷为低度结合(25%)外，原儿茶酸、绿原酸和松脂醇单葡萄糖3个成分为中度结合。采用SPSS 18.0软件进行方差分析，表明在所研究的浓度范围内，京尼平苷酸等5种成分不存在质量浓度依赖性(P>0.05)。

参考文献

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http://dx.doi.org/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.028
中国科协主管，中国药理学会主办

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曹旭, 谢玉敏, 朱迪, 陈鹏程, 巩仔鹏, 王爱民

CAO Xu, XIE Yu-min, ZHU Di, CHEN Peng-cheng, GONG Zi-peng, WANG Ai-min

杜仲提取物中五个成分血浆蛋白结合率的测定

Determination of plasma protein binding rate of five components in Eucommia ulmoides extract

中国药理学通报, 2015, 31(1): 131-135

Chinese Pharmacological Bulletin, 2015, 31(1): 131-135.

http://dx.doi.org/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.028

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收稿日期：2014-09-24

修订日期：2014-10-29

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