MicroRNAs (miR)是一类内源性非编码单链RNA，通过结合靶基因mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)，介导靶基因mRNA降解，调控转录后基因表达^[1]，进而参与体内各系统生理及病理过程。心血管研究表明，miR密切参与调节血管生成、心脏发育、心力衰竭、缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤等病理生理过程，并可能是其中的关键性调节因子^[2]。本室前期研究发现，miR-139-5p在经历肢体缺血预适应(limb ischemic preconditioning,LIPC)和经历I/R损伤的大鼠心肌中的表达存在明显差异，提示miR-139-5p可能在LIPC所提供的心脏保护中发挥关键性调节作用。为进一步研究miR-139-5p的功能，本研究拟构建miR-139-5p低表达慢病毒表达载体，并包装成病毒感染大鼠H9c2心肌细胞，为探讨其参与心脏保护作用的分子机制奠定实验基础。

慢病毒载体系统包括pGC-LV载体，pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体(Genechem公司)；H9c2细胞(ATCC，美国)；293T细胞、大肠杆菌菌株DH5α(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。

AgeI、EcoRI限制性内切酶、T4连接酶(NEB公司，美国)；Taq 酶 (SinoBio)；质粒抽提试剂盒(Promega，美国)；In-Fusion^TM PCR Cloning Kit(clontech，美国)；DMEM培养基(低糖)、胎牛血清(Hyclone，美国)；胰蛋白酶(Sigma，美国)；TRIzol RNA分离试剂、M-MLV逆转录试剂盒、Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)；SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix (2×) Universal (KAPA Biosystem)；RT-PCR仪(Mastercycler，Eppendorf，德国)；BIO-RAD IQ5多重实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,美国)；凝胶成像仪(天能公司)；Thermo Forma 3111型CO₂孵箱、Nanodrop2.0核酸测定仪(Thermo，美国)；CK40-F200型倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。

靶点序列及合成寡核苷酸双链 通过miRBase数据库查询到miR-139-5p (MIMAT0000845) 序列为5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG-3′。利用Invitrogen 网站(http://maidesigner.invitrogen.coni/maiexpress/design.do)，设计合成miR-139-5p 靶点序列5′-CTGGAGACACGTGCACTGTAGA-3′，经GenBeank数据库的BLAST检索，确认目的基因序列没有其它同源序列。合成寡核苷酸双链，正义链：5′-AATTCAAAAATCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3′；反义链：5′-CCGGCTGGAGACACGTGCACTGTAGATTTTTG-3′。

将双链DNA片段和经AgeI和EcoRI酶切后线性化的载体pGC-LV质粒在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。将连接后的产物转化氯化钙法新鲜制备的DH5α感受态细胞，菌液涂布在AMP抗性(100 mg·L^-1) LB培养平皿，37℃培养16 h。筛选阳性克隆并进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆(pGC-LV-miR-139-5p)进行测序分析。菌落PCR引物序列：上游5′-GGAAAGAATAGTAGACATAATAGC-3′；下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。 测序引物序列5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′。

调整HEK293T细胞密度为6×10⁸·L^-1，接种于15 cm培养皿，5% CO₂、37℃条件下培养箱内过夜。待细胞融合度达70%~80%时，将pGC-LV-miR-139-5p、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒在Lipofectamine 2000作用下共转染HEK293T细胞。8 h后更换为完全培养基，继续培养48 h。收集细胞上清液，于4℃、4 000 r·min^-1离心10 min。上清液用0.22 μm滤器过滤，浓缩后于-80℃保存。命名为miR-139-5p inhibition。

以每孔4×10⁷·L^-1的密度将HEK293T细胞接种于96孔板，每孔100 μL。37℃、5% CO₂培养24 h后进行病毒滴度测定。取7个Ep管，在每个管中加入90 μL无血清培养基。取待测定的病毒原液10 μL加入到第1个管中，混匀后取10 μL加入到第2个管中。依次倍比稀释至最后1管。选取所需细胞孔，吸出90 μL培养基，加入90 μL对应稀释好的病毒溶液，继续培养。24 h后，加入完全培养基100 μL。4 d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。根据表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的HEK293T细胞数目计算病毒滴度。

以含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养H9c2细胞，按4×10⁷·L^-1密度接种于25 cm²培养瓶中，在37℃、5% CO₂孵箱中孵育24 h。待细胞融合度达30%左右时，加入用含10% FBS的DMEM培养基稀释好的重组慢病毒或空载病毒以及促感染剂polybrene (5 mg·L^-1)，感染H9c2细胞。24 h后更换为新鲜培基。细胞感染后3 d，用嘌呤霉素(1 g·L^-1)进行3次细胞筛选。之后在显微镜下检查GFP荧光表达情况以判断感染效率。转染效率(荧光率)大于95%，说明已经筛选出稳定表达的细胞系。

用TRIzol提取总RNA，使用反转录试剂盒得到cDNA后，进行实时定量PCR反应。RT引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGGAGAC-3′；PCR上游引物5′-CAGCGGTCTACAGTGCACGT-3′，PCR下游引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR反应体系 (20 μL)：10 μL KAPA Mix (2×)、0.2 μL miR-139-5p Primer up (10 μmol·L^-1)、0.2 μL miR-139-5p Primer down (10 μmol·L^-1)、1 μL稀释4倍的cDNA，用双蒸水定容。PCR程序：95℃预变性3 min；95℃ 5 s、65℃ 20 s，40个循环；分析熔解曲线。使用2^-△△CT法计算miRNA相对表达量。

采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以 ± s表示。两组间比较采用非成对t检验。

重组质粒pGC-LV-miR-139-5p经测序后，结果与目的片段一致(Fig1)，说明载体构建成功。

Fig 1 Sequencing results of recombinant plasmids pGC-LV-miR-139-5p

图选项

将低表达重组慢病毒表达质粒pGC-LV-miR-139-5p与 pHelper 1.0和pHelper 2.0包装质粒共转染HEK293T细胞，倒置荧光显微镜下可见大量绿色荧光颗粒，细胞生长状态良好，慢病毒包装成功。梯度滴定法测定miR-139-5p inhibition 病毒滴度为8×10¹¹ TU·L^-1。

将重组慢病毒miR-139-5p inhibition或其阴性对照载体(control)感染H9c2细胞，72 h后均观察到有GFP表达。从荧光观察结果可见目的细胞的感染效率达到95%以上，说明构建的慢病毒载体转染有效(Fig2)。4 d后，收集细胞进行实时定量 PCR检测miR-139-5p基因表达情况。与control组相比，miR-139-5p inhibition组miR-139-5p表达量明显降低(P<0.01)。见Fig3。

Fig 2 GFP expression of lentivirus infection of H9c2 cells (×100) A: miR-139-5p inhibition; B: Control

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Fig 3 Statistical analysis showing expression of miR-139-5p in H9c2 cells using real-time PCR (n=3， ± s) **P<0.01 vs control

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心肌miR的表达变化参与多种心血管疾病的发生和发展^{[3, 4]}。已有研究发现心肌I/R损伤或心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)损伤可诱导多种miR表达变化^{[5, 6, 7, 8]}。亦有研究证实miR在心肌I/R或H/R损伤中发挥重要的调节作用。抑制miR-92a或miR-7a/b的表达可以缩小心肌I/R损伤所致的梗死面积，减少H/R诱导的心肌细胞凋亡^[9，10]。在体大鼠心脏miR-125b或miR-22表达增加可明显缩小I/R诱导的心肌梗死面积，并减少心肌细胞凋亡^{[11 ,12]}。可见，以miR为靶点的研究可能为心肌I/R损伤提供有效的防治策略。

目前针对miR-139-5p的研究主要集中在肿瘤领域，其可能是食管鳞状细胞癌早期诊断和预测的潜在的生物标记物^[13]，并可能是乳腺癌代谢途径的重要调控子^[14]。也有少量研究报道出现在脑和神经系统，提示miR-139-5p可以减弱12 h缺血缺氧诱导的新生小鼠的大脑损伤^[15]。miR-139-5p在心血管系统疾病中的作用尚未见文献报道。

本实验室前期研究发现，miR-139-5p在经历LIPC和I/R损伤的大鼠心肌中的表达呈现反方向的变化趋势，其在LIPC组心肌组织表达减少，而在I/R组表达增加。考虑到I/R的损伤作用和LIPC的保护作用，推测其表达变化可能LIPC所提供的心脏保护中发挥关键性调节作用。为进一步研究miR-139-5p的功能，本研究构建miR-139-5p低表达的H9c2稳定细胞株。前期实验中发现，利用脂质体将重组质粒转染入H9c2心肌细胞的效率仅为5%，难以筛选出稳定转染的细胞株。而慢病毒载体包容量大，可将其携带的目的基因整合到宿主细胞基因组，使外源基因能够长期稳定表达，且能够有效转染周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化后的后代细胞，实现在多种类型的细胞中特异而稳定地表达目的基因，从而快速而高效地研究基因功能。故最终选择慢病毒载体系统感染H9c2心肌细胞，实现抑制miR-139-5p表达的目的。研究表明，重组慢病毒是携带目的基因进入H9c2细胞的有效方法，MOI值为1 ∶250时转染效率几乎可达100%。

总之，本研究成功构建了miR-139-5p低表达慢病毒载体，并包装成病毒感染大鼠H9c2心肌细胞，建立了稳定转染的miR-139-5p低表达H9c2心肌细胞株，为探讨其参与心脏保护作用的分子机制奠定实验基础。