硫酸乙酰肝素(HS)是广泛分布于动物组织中的直链状硫酸化多糖，在胚胎生成、细胞骨架组成、细胞迁徙、创伤愈合、炎症、肿瘤转移、血管生成等一系列生物反应中发挥关键性作用。体外、体内实验显示，HS具有确切的抗肿瘤细胞增殖、转移的作用^{[1, 2]}。从猪小肠肥大细胞中提取出来的UFH和HS一样是以氨基葡萄糖和艾杜醛酸二糖为单位连接起来的硫酸化多糖，该多糖具有较高的抗凝血活性，作为抗凝血药物广泛用于临床。近年来它们所表现的抗肿瘤细胞增殖、侵袭和转移作用，越来越受到人们的关注，特别是其结构与抗肿瘤活性之间的关系已成为研究的焦点^[3]。

为了研究肝素酰化位置和抗肿瘤细胞增殖活性之间的关系，研究人员通过制备多糖铵盐，然后在高效催化剂二甲氨基吡啶(DMAP)的作用下进行酰化反应，得到低抗凝血性低分子肝素丁酰化物，这种低分子肝素丁酰化物抗凝血活性明显下降，而抗增殖活性明显提高，但是，30 mg·kg^-1的给药剂量，几乎没有临床应用可能性^[4]。

本实验参照文献^[5]，氧化还原方法制备低抗凝血性低分子肝素(LMWH)，在此基础上利用DCC/DMAP催化体系，对该LMWH糖环上的羟基进行乙酰化，同时对艾杜醛酸的羧基进行酰基脲修饰，制得低抗凝血性的乙酰化低分子肝素(acetylated low molecular weight heparin,ALMWH)。在X线衍射(XRD)试验、差示扫描量热(DSC)试验，对其结构、构型、理化性质进行研究基础上，对其体外抗肿瘤细胞增殖、转移性能，抗凝血活性进行了检测。

MDA-MB-231、MCF-7，购自ATCC (Manassas,VA)。蚌埠医学院生化药理研究室冻存培养。

新西兰兔(普通级)，♀，体质量(2.3±0.3) kg。随机分为3组，对照组、LMWHP组和ALMWH组，每组6只。

MEM培养基、胰蛋白酶、HEPES购于Gibco公司、青链霉素、庆大霉素为市售。胎牛血清购于杭州四季青公司。人工重建基底膜材料Matrigel，购于Sigma公司。Transwell小室(24 孔，0.8 μm)购于Corning公司。市售低分子肝素(LMWHP)购于江苏万邦生化医药股份有限公司。100B-ACT监测仪(北京科仪诚科技开发中心)。LMWH和ALMWH(安徽省生化药物工程技术研究中心自制，专利号201210574597.1)

经凝胶渗透色谱测知，由UFH降解而得的LMWH的分子量为5683 g/mol，ALMWH的分子量为7707 g/mol。将得到的LMWH或ALMWH粉末在日本MXPAHF型射线衍射仪上扫描,电压40 kV，电流200 mA,TTRAX3θ测角，扫描范围3～60°，扫描速度8°min^-1。可得到LMWH和ALMWH的X射线光谱图。

取5 mg ALMWH和LMWH试样于铝坩锅中,N₂气保护。升温速率为20 ℃·min^-1，第1次扫描升温至160℃，自然冷却至室温后，第2次扫描升温至180℃，得DSC曲线。

从家兔心脏取血，注入含有柠檬酸钠的采血管，加药，注入硅藻土测定管，记录激活凝血时间(ACT)。

按(3～7)×10⁴细胞/皿的胞密度接种人乳腺癌MDA-MB-231细胞于含有改良的MEM培养基中(10％的灭活FCS，20 mmol·L^-1 Hepes，2.0 g·L^-1碳酸氢钠，1×10 IU·L^-1青霉素，100 mg·L^-1链霉素，10 mg·L^-1庆大霉素，0.33 mg·L^-1胰岛素)，37.0℃、95％空气、5％ CO₂温湿环境下培养。24 h后，吸弃培养液，用无FCS的MEM淋洗细胞2 次，复换以低血清(0.1％FBS)培养液继续培养24 h。继之用0.26、1.29、6.49 μmol·L^-1浓度的ALMWH和LMWH处理细胞，于用药后48 h用胰酶释放游离细胞，分别收集、计细胞数。增殖抑制率按下述公式计算：

肿瘤细胞在体外仍然具有迁移能力，细胞划痕实验可以直观的观察划痕后的细胞迁移和侵润能力。12孔板背面做标记，每隔0.5 cm垂直于横轴划痕，每个孔上划痕3条，取对数生长期MDA-MB-231细胞，按每个孔15万个细胞加入孔中，待90%汇合时，沿预先标记好的线划痕。用PBS洗去划痕脱落的细胞，加入含不同药物的无血清培养基，置于5%CO₂，37℃，饱和湿度条件下培养，于0、24 h于倒置显微镜下观察细胞的迁移情况。实验分阴性对照组、LMWH组、ALMWH组，每孔设3个复孔，实验重复3次，显微镜下观察细胞迁徙程度，测定细胞的迁移距离。侵袭抑制率按下述公式计算：

将Materigel胶与预冷的无血清MEM培养基按1∶8的比例稀释，50 μL/孔均匀包被在Transwell小室底部膜的内表面，送入细胞培养箱30 min使之成胶。取对数生长、且无血清培养基处理12～24 h的肿瘤细胞，消化离心后，用无血清培养基进行重悬计数。每个内室加入200 μL(含2×10⁴个细胞)含或不含药物的细胞悬液。于24 孔板即外室中加入700 μL的含5% 胎牛血清的MEM培养基。在1 h内每隔10 min观察一次下室，避免有气泡产生。然后移培养箱，于37℃、5% CO₂、饱和湿度下培养48 h。取出小室，用PBS 清洗两次，90% 乙醇固定10 min，用PBS湿润的棉签轻轻擦去上室表面未侵袭的细胞，1%结晶紫染液室温下染色10 min。PBS漂去多余染料，显微镜下每孔随机取5个视野拍照，计数并计算抑制率。

数据以 ± s表示，采用t检验进行统计学分析。

将得到的LMWH和ALMWH粉末在日本MXPAHFX射线衍射仪上扫描,得到LMWH和ALMWH的X射线光谱图。从衍射光谱可以看出，两个非晶鼓包半峰宽并无明显差距，说明ALMWH和LMWH一样，仍然属于非晶结构，ALMWH上的两个锐锋是ALMWH分子表面吸附的NaCl的吸收。

Fig 1 X-ray diffraction analysis of LMWH and ALMWH

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如Fig2所示，LMWH在0~180℃升温过程中，在(43.68~48.93)℃(该温度属于老化温度)处有一个缓慢的热吸收。在(148~160)℃有一个强吸热峰，是LMWH失去结合水产生的热吸收。ALMWH的老化温度明显变宽，为(41.14~56.60)℃。(103.48~109.32)℃处有个小的吸收，是ALMWH中自由水失水产生的热吸收，其结合水失水产生的热吸收温度变低，吸收带变宽，为(117～160)℃，吸收峰变大。提示ALMWH有新的吸水性取代基存在，ALMWH对于水的结合能力增强。

Fig 2 Differential scanning calorimetry of LMWHP and ALMWH

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为了检验ALMWH是否降低了抗凝血活性，将市售LMWHP和ALMWH用家兔血浆各配制8个浓度进行ACT测定。结果如Tab1所示,ALMWH的抗凝血活性较市售LMWHP明显降低，尤其在低浓度范围内(0.13～1.04 μmol·L^-1)，ALMWH表现出极低的抗凝活性，0.26 μmol药物浓度的ALMWH与LMWHP比较，LMWHP抗凝活性明显提高，ALMWH抗凝血活性较LMWHP明显降低。

Tab 1 Activated clotting time of LMWHP and ALMWH(ACT)

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LMWH和ALMWH抗肿瘤细胞增殖效应的结果见Fig3,Fig4。1.3 μmol·L^-1的ALMWH即可对MDA-MB-231、MCF-7细胞的增殖产生明显的抑制作用，且随着处理时间的延长，对肿瘤细胞的增殖抑制作用增强。ALMWH对于肿瘤细胞增殖活动呈现出明显的剂量依赖性。

Fig 3 Effect of ALMWH on the proliferation of MDA-MB-231 LMWH from UFH was degraded by sodium periodate treatment followed by sodium borohydride reduction. ALMWH was from the acetylation of the LMWH. The results were from 3 separate experiments (total n=9)*P < 0.05,**P < 0.01 vs control,and #P < 0.05,##P < 0.01 vs LMWH.

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Fig 4 Effect of ALMWH on the proliferation of MCF-7 The results were from 3 separate experiments (total n=9)*P<0.05,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs LMWH

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划痕实验是测定肿瘤细胞迁移能力的方法之一。在培养的单层细胞上划痕，然后加入药物观察其对肿瘤细胞迁移的影响。不同药物对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制见Fig5、Tab2。经3个不同浓度(3.9、12.9、38.9 μmol·L^-1)LWMH处理的MDA-MB-231细胞24 h，细胞保持着活跃的迁移能力，与此相比，3个不同浓度的ALMWH表现出对乳腺癌细胞迁移的明显抑制，抑制率均达到40%。

Fig 5 Effects of ALMWH and LMWH on migration of breast cancer cells (Magnification: 40 times)

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Tab 2 Inhibitory effect(%) of LMWH and ALMWH on the invasion of MDA-MB-231 cells

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ALMWH抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭实验结果见Fig6。3.9、12.9、38.9 μmol·L^-1的LMWH和ALMWH分别处理MDA-MB-231细胞48 h后，将侵袭和迁移的细胞进行固定染色，分别于200×和400×显微镜下拍照并计数统计(Tab3)，可见3.9、12.9 μmol·L^-1的LMWH对MDA-MB-231细胞的侵袭无抑制作用，38.9 μmol·L^-1的LMWH显示30%的侵袭抑制率。但ALMWH对于MDA-MB-231细胞的侵袭抑制作用明显，38.9 μmol·L^-1的ALMWH对于MDA-MB-231细胞的侵袭抑制作用达到51%。

Fig 6 Impacts of ALMWH and LMWH on invasive activity of MDA-MB-231 cells

图选项

Tab 3 Inhibitory effect(%) of LMWH and ALMWH on the invasion of MDA-MB-231 cells

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HS具有明显的抗肿瘤细胞增殖的作用^{[1, 2]}。而UFH的这种作用要低得多，且抗凝血活性强，易引发出血，限制了其作为抗肿瘤药物的应用。HS与UFH在分子结构上的主要区别在于硫酸化程度与艾杜醛酸的含量。HS的低硫酸化、高乙酰化、低艾杜醛酸量，这种分子结构有利于其与UFH/HS结合蛋白相互作用，完成多种多样的生理调控作用。UFH硫酸化程度高，艾杜醛酸含量高^[7]，分子链比HS更加柔软，易曲挠、易旋转^[8]。我们用氧化还原方法断裂了艾杜糖醛酸的C₂-C₃键，使其抗凝血活性大为降低(Tab1)。在此基础上利用DCC/DMAP催化体系对LMWH的艾杜醛酸的羧基进行酰基脲修饰，并进行糖环上羟基的乙酰化，所制得的低抗凝血性的ALMWH，经X射线检测，ALMWH和LMWH虽同属非晶结构，但DSC分析则证明ALMWH中有新的结合水与自由水存在，说明对LMWH艾杜醛酸的羧基的酰基脲修饰是成功的。氢核磁¹-HNMR检测显示ALMWH的2.3 ppm的乙酰基的积分面积比LMWH 2.0 ppm处的积分面积明显增加，证实LMWH的羟基确产生了乙酰化修饰。从艾杜醛酸的一位碳上氢质子吸收峰在5.2 ppm处有4个分裂，证实艾杜醛酸亦被选择性修饰。

市售低分子肝素对乳腺癌细胞的增殖活性的抑制虽呈剂量依赖性，然而在低剂量时作用不明显^[9]。本研究用氧化还原方法制备了LMWH后，用DCC/DMAP催化体系对该LMWH糖环上的羟基进行乙酰化，所获得的ALMWH在低浓度(0.26、1.29、6.49 μmol·L^-1)时即表现较之LMWH为大的抗肿瘤细胞增殖作用，说明通过对LMWH的化学改造确可提高LMWH的抗癌活性，并能降低其抗凝血活性。

LMWH抗肿瘤细胞侵袭转移也被业界公认^[10]。低抗凝血性LMWH可以明显抑制胰腺癌的黏附和转移^[11]。但是，其抗转移作用机制并不十分明了。转移是一个复杂过程，表现为多阶段性、多基因参与多种转录因子调控，并涉及肿瘤细胞异常增殖、黏附、运动、细胞外基质降解，血管生成^{[12, 13, 14]}。Sudha等^[11]用LMWH抑制胰腺癌转移的最低起效给药剂量为20 mg·kg^-1，据此，用于抑制乳腺癌细胞迁移的浓度选定于3.89、12.98、38.93 μmol。实验结果显示，在该浓度的LMWH对于乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移几无作用。而同样3种浓度的ALMWH却表现出明显的抗迁移作用。

ALMWH比LMWH具有增强的抗乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、转移作用。抗凝血活性低，出血性风险低，与水分子结合能力强。本研究为低毒性抗肿瘤药物筛选提供了基本方法。