食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位^[1]，5年生存率低于15%^[2]，但其发病机制尚不十分清楚，且目前的治疗效果不甚理想。

在正常生理状态下，细胞分化与凋亡维持在平衡状态。当细胞不能接受信号启动凋亡，处于无限生长状态就可能引起肿瘤的发生。如抑癌基因p53表达降低与多种肿瘤发生密切相关，包括食管癌。p53可引起细胞周期阻滞、凋亡及维持基因组稳定性从而抑制肿瘤^[3]，但是p53在食管癌中失活的机制有待进一步阐明。

磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1，PLCE1)是近年发现的磷脂酶C家族的新成员，其定位的染色体是最近发现的食管鳞癌易感位点。PLCE1在细胞信号转导过程中起重要作用，调节细胞生长、增殖、分化，影响细胞骨架改变、细胞运动、细胞凋亡、肿瘤生长及发展等生物学行为。本研究拟通过检测PLCE1在食管癌细胞株OE33和CP-C中的表达，验证改变PLCE1表达对食管癌细胞功能的影响，初步阐明PLCE1通过p53途径在食管癌细胞中发挥作用的机制。

PLCE1抗体(sc-28402)、p53抗体(sc-6243)、兔抗羊(sc-276)及羊抗兔二抗(sc-2004)、β-actin抗体(sc-130301)、PLCE1 siRNA(sc-44024)和对照siRNA(sc-37007)购自Santa Cruz Biotech。Annexin V试剂盒购自Sigma。DNA纯化盒购自Promega。甲基化检测盒购自Clontech。转染试剂lipofectamine2000、质粒抽提试剂盒、qRT-PCR和Western blot所用试剂均购自Invitrogen。PLCE1过表达载体(pcDNA3.1-PLCE1 )由中山大学肿瘤医院刘晓萍博士惠赠。

食管癌细胞株OE33、CP-C及正常细胞株HEK293均购于中科院上海细胞库，用含10%胎牛血清、2 mmol·L^-1谷氨酰胺、100 kU·L^-1青霉素和0.1%链霉素的DMEM细胞培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5%CO₂、饱和湿度)连续培养并传代。培养液每3 d换液1次。当细胞长至瓶底80%时进行处理。细胞转染，根据转染试剂说明书进行，分别将siRNA及对照无关系列或PLCE1过表达载体、对照载体转染至食管癌细胞中，并设空白对照；转染48 h后提取总RNA或进行细胞凋亡检测，转染72 h后提取细胞总蛋白。

TRIzol法提取细胞总RNA并定量；按试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。应用实时荧光定量RT-PCR检测，β-actin作为内参。PCR引物：p53：上游引物5′-GGAAATCTCACCCCATCCCA-3′，下游引物 5′-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3′；PLCE1：上游引物5′-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3′，下游引物 5′-AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3′； β-actin(上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。反应体系为20 μL，反应条件为95℃ 3 min预变性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线，基因的表达量用2^-ΔΔCt表示。

预冷PBS洗涤细胞3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收集蛋白。将抽提蛋白用BCA法定量后，取50 μg于100 V泳道进行SDS-PAGE；电泳结束后，以90 V、90 min将蛋白转移至PVDF膜； 5%TBS牛奶室温封闭1 h，孵育一抗羊抗p53(1 ∶ 1 000)、兔抗PLCE1 (1 ∶ 500)4 ℃过夜，二抗(兔抗羊1 ∶ 5 000、羊抗兔1 ∶ 2 000)室温孵育1 h。每次抗体孵育后用TBST洗膜15 min，共3次。ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹并进行图像分析。

根据试剂盒进行操作，收集CP-C细胞先用Annexin V染色，再用碘化丙啶 (propidium iodide，PI，5 mg·L^-1，15 min)染色。流式细胞仪检测细胞凋亡率，PI⁺细胞首先被检出，Annexin V⁺细胞频数在剩余细胞中确定。

用基因组DNA纯化试剂盒提取细胞gDNA，甲基化检测盒重亚硫酸盐法检测p53甲基化状态。p53启动子甲基化引物：上游引物 5′-TTTCGTTTTTAAAGTTAGGTTTCGT-3′，下游引物 5′-TCTCTAAATACTTCCGACGCG-3′；非甲基化引物：上游引物 5′-TTTTGTTTTTAAAGTTAGGTTTTGT-3′，下游引物 5′-CTCTCTAAATACTTCCAACACACC-3′。1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，紫外光检测仪下观察、摄像。

计量数据用 ± s表示。应用统计学软件SPSS For Windows 19.0进行处理，两组间比较用Student t检验，多组间比较用ANOVA检验。

本研究检测了食管癌细胞株OE33和CP-C细胞中PLCE1的表达。结果发现，OE33和CP-C细胞中PLCE1的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常细胞HEK293，差异有统计学意义(P＜0.01)(Fig1)。

Fig 1 Eca cells express high levels of PLCE1(n=26) A:The bars indicate the relative mRNA levels of PLCE1 of OE33 and CP-C cells;B1-B2:The expression of PLCE1 protein was detected by Western blot,**P＜0.01 vs HEK293 cell.

图选项

将PLCE1 siRNA转染至食管癌CP-C细胞中，抑制PLCE1的表达，检测细胞凋亡情况。结果表明，PLCE1 siRNA组细胞凋亡率最高，空白对照组(mock)与转染无关系列组(scramble)差异无显著性，PLCE1 siRNA与其它两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)(Fig2)。

Fig 2 Suppression of PLCE1 induces apoptosis in CP-C cells(n=26) A:The dot plots indicate the frequency of dead CP-C cells (PI+) and apoptotic cells (Annexin V+);B-C:The bars indicate the summarized data of dead cells (B) and apoptotic cells (C),**P＜0.01 vs mock.

图选项

进一步采用qRT-PCR与Western blot检测PLCE1对食管癌CP-C细胞中p53表达的影响。结果发现，抑制CP-C细胞中PLCE1的表达后，p53表达上调。而在HEK293细胞过表达PLCE1后，p53表达下调(Fig3)。

Fig 3 Inhibition of PLCE1 upregulates expression of p53 in Eca cells(n=26) A:PLCE1 inhibited expression of p53 mRNA;B1-B2:The levels of p53 protein was detected by Western blot.C1-C2:The Western blot showed the expression of PLCE1 in HEK293 cells.D1-D2:The PLCE1 gene knockdown results.Mock:Untreated group;siRNA:Treated with PLCE1 siRNA.scramble:Treated with control siRNA.HEK293 cells were treated with mock (HEK293a),or pPLCE1(PLCE1 overexpression plasmid)(HEK293b),or control plasmid (HEK293c).**P＜0.01 vs mock.

图选项

甲基化特异性PCR结果提示HEK293细胞中甲基化状态的p53 小于20%，而CP-C细胞中，甲基化状态的p53 大于75%。干扰CP-C细胞中PLCE1表达后，p53启动子甲基化状态明显下调，而HEK293细胞过表达PLCE1后，p53启动子高甲基化(Fig4)。

Fig 4 PLCE1 induces p53 promoter methylation(n=26) HEK:HEK293;PLCE1-d:PLCE1 siRNA;csiRNA:Scramble;PLCE1 O-ex:PLCE1 plasmid;M:Methylated primer;U:Un-methylated primer.**P＜0.01 vs HEK cells

图选项

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生发展的分子机制多样。研究表明，基因突变、等位基因高频率杂合性缺失(LOH)、抑癌基因失活等均可促进食管癌的发生发展。如DNA聚合酶β(DNA polymerase β，DNA polβ)启动子发生突变，在食管癌细胞中表达增加^[4]。抑癌基因p53所在染色体17p13区域存在LOH，导致表达失活，食管癌发生^[5]。

最近两项大样本全基因组关联研究(GWAS)发现了新的食管癌易感基因位点rs2274223，定位于染色体10q23的PLCE1基因^{[6, 7]}。PLCE1是近年发现的磷脂酶C家族的新成员，在细胞信号转导过程中起重要作用，调节细胞生长、增殖、分化，影响细胞骨架改变、细胞运动、细胞凋亡、肿瘤生长及发展等生物学行为^{[8, 9]}。目前有关食管癌中PLCE1表达水平的报道结果不尽一致，Chen 等^[10]报道哈萨克族食管癌患者中PLCE1表达升高，其表达水平与肿瘤分期正相关。Hu等^[11]则报道食管癌组织中PLCE1 mRNA表达水平下降，免疫染色分析提示基因型rs2274223 GG者 PLCE1染色分数低于AG型。而我们的研究发现PLCE1在食管癌细胞OE33和CP-C中均高表达，与chen的研究结果一致。分析出现这种情况的可能原因有：(1)样本数有差异；(2)种族差异；(3)环境因素。

表观遗传学调控是当今生命科学关注的前沿，在基因调控中起重要作用，其涉及的机制主要包括DNA甲基化、miRNA、组蛋白修饰及染色质重塑等。DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5′-CpG-3′的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b)。Dnmt1是一种维持性甲基化酶；Dnmt2可与DNA上特异位点结合；Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化。众多研究发现，在肿瘤发生发展的过程中，DNA甲基化能关闭某些抑癌基因的活性，去甲基化则诱导了癌基因的重新活化和表达^[12]。本研究发现，CP-C细胞中甲基化状态的p53 大于75%，而抑制CP-C细胞中PLCE1的表达后，p53表达上调，p53启动子甲基化状态明显下调，提示抑癌基因p53启动子高甲基化在食管癌的发生发展中发挥重要作用。

细胞凋亡下调是肿瘤发生的重要原因之一，众多因子参与细胞凋亡的调控，如TNF-α促进细胞凋亡^[13]，GS-459679抑制细胞凋亡^[14]，SCO2 (细胞色素C氧化酶2合成物)可诱导p53表达从而促进细胞凋亡^[15]。大量研究证实^[16]，p53与细胞凋亡密切相关，p53能通过高尔基复合体转运Fas短暂促进血管平滑肌细胞表面Fas表达并促进Fas-FADD的结合诱导凋亡。肿瘤细胞过表达p53能诱导细胞凋亡，而特异性抑制剂分别抑制caspase-8及caspase-9后均能抑制这种p53依赖的凋亡，表明p53对死亡受体通路和线粒体通路均有影响^[17]。通过本研究发现，抑制食管癌细胞中PLCE1的表达可促进p53的表达，进而促进食管癌CP-C细胞凋亡。

综上所述，我们推测，PLCE1通过促进p53启动子区甲基化抑制p53 的表达，从而抑制食管癌细胞凋亡。PLCE1可能成为食管癌治疗的新靶点。