2.江苏省药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210046
2. Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210046, China
TNF-α是一个典型的促炎症细胞因子，包括可溶性的TNF-α (sTNF-α)和膜相关的TNF-α (mTNF-α)两种形式，主要由巨噬细胞分泌，同时恶性肿瘤细胞、成纤维细胞以及内皮细胞等也能分泌TNF-α[1]。TNF-α有两种受体：p55 receptor (TNFR-1)和p75 receptor (TNFR-2)，TNF-α以三聚体的形式和细胞表面的两种受体结合，从而发挥生物学效应。TNF-α的表达调控分为转录调控和转录后调控[2, 3]，TNF-α的mRNA的3′端非翻译区(untranslated region，UTR)存在富含腺嘌呤核苷与尿嘧啶核苷的元件(adenosine and uridine rich element，ARE)，可与多种ARE结合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)特异性结合，在转录后水平调控其基因的表达[4]。TNF-α参与多种肿瘤的发生发展，其主要参与肿瘤血管生成过程[5]。更有研究显示TNF-α在体内[6]、体外[7]都是一个不可忽视的抗血管生成因子。在肿瘤发生发展过程中，不论是恶性肿瘤细胞自分泌还是通过肿瘤微环境中的炎性细胞的旁分泌都能产生TNF-α，诱导肿瘤血管生成[8, 9]，促进肿瘤的恶性演进。
丹参作为临床上抗肿瘤治疗应用最多的活血化瘀中药，在中医治疗肿瘤中发挥着重要的作用，丹参的主要抗肿瘤活性成分包含脂溶性和水溶性成分两大类，其中脂溶性成分主要包括含有邻醌或对醌结构的多种丹参酮，包括丹参酮I(TI)、丹参酮IIA(TIIA)、隐丹参酮(CT)、二氢丹参酮I(DTI)。本课题组长期从事活血化瘀中药抗肿瘤的研究[10, 11]，丹参中部分成分能够明显下调TNF-α的表达而抑制肿瘤转移[12]。本研究通过构建TNF-α 3′-UTR双荧光素酶报告基因表达系统，体外转染至高表达TNF-α的单核巨噬细胞RAW264.7细胞，旨在从隐丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮I中筛选出对TNF-α转录后水平进行调控的有效成分，为高通量筛选转录后调控TNF抗肿瘤药物提供新的途径和思路。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂小鼠RAW264.7细胞、受体菌 E.eoli DH5α购于中国科学院上海细胞生物学研究所。丹参酮I纯度为98%，西安和霖生物工程有限公司，货号：568-73-0；隐丹参酮纯度为98%，西安和霖生物工程有限公司，货号：35825-57-1；丹参酮IIA纯度为98%，西安和霖生物工程有限公司，货号：35825-57-1；二氢丹参酮I纯度为98%，西安和霖生物工程有限公司，货号:87205-99-0；脂多糖(美国Sigma公司，Cat NO.L4130)；Dual-Luciferase® Reporter 1000 Assay System(Promega公司，Cat NO.E1960 Lot NO.0000026815);限制性内切酶(EcoRI、BamHI) 、T4DNA连接酶、KOD保真酶(Sigma公司)； AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit(Axygen公司，Cat.NO.AP-MN-P-250G Lot.NO.05213KA1)；Endo-free Plasmid Mini Kit I(OMEGA公司，Cat.NO.D6948-01B Lot.NO.00D694801B0000J08L027)；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(Axygen公司，Cat.NO.AP-GX-250 Lot.NO.KE10120804-G)。Western blot所涉及抗体：GAPDH(Bioworld，AP0063)，TNF-α(Abgent，AO1131a)PCR仪(ABI公司，型号：Veriti 96 well Thermal Cycler)荧光素酶报告基因检测仪(Promega公司，型号：GloMax20/20)凝胶成像系统(美国Bio-Rad，型号：GelDoc 2000)
1.2 实验方法 1.2.1 引物及其合成根据人TNF-α基因的3′UTR的片段(全长799 kb)，采用 Primer Premier 5.0软件进行PCR 引物设计，引物由南京金斯瑞公司合成。引物序列如下：F: 5′-TCTAGAGGAGGACGAACATCCAACCT-3′;R: 5′-TCTAGATTTCTTTTCTAAGCAAACTTTATTTCTCGCC-3′。其中TCTAGA为XbaI酶切位点。
1.2.2 基因组DNA的提取及PCR扩增按照试剂盒说明提取RAW264.7细胞基因组DNA作为PCR扩增模板，使用KOD保真酶进行PCR反应，反应体系为20 μL体系，其中，2×KOD buffer 10 μL，Primer (F&R) 2.4 μL，Template (HUVEC cDNA) 1 μL，KOD Fx 0.4 μL，dNTP 4 μL，MilliQ 2.2 μL。反应条件为: 95℃预变性2 min，98℃变性10 s，65℃退火15 s，68℃延伸1 min，进行35个循环，68℃延伸10 min，16℃保存。取PCR 反应产物进行1%琼脂糖电泳分离，切胶回收。
1.2.3 pGL-3-TNF-α 3′UTR荧光素酶报告基因的构建及其鉴定对PCR产物进行过柱纯化，获得加A产物后，将加A产物与T4载体相，连接产物转化于大肠杆菌 DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，将鉴定正确的克隆菌液送至金斯瑞公司测序。将测序正确的质粒取出与pGL-3 control质粒分别用XbaI酶切，其中pGL-3 control质粒进行碱性磷酸酶处理，切胶回收目的片段，将切胶回收的产物与pGL-3 control载体相连，连接3 h后进行转化涂板和质粒小提，构建成 pGL-3 control -TNF-α-3′UTR重组载体。PCR鉴定有pGL-3 control 质粒是否含有所需片段。采用EcoRI、BamHI双酶切鉴定插入方向，并进行去内毒素质粒提取。
1.2.4 质粒转染用含10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养液培养RAW264.7，B16F10细胞，于 37℃ 5% CO2条件下培养、传代，采用lipofectamine-2000 转染试剂将上述所构建的pGL-3-TNF-α 3′UTR质粒和Rellina Luciferase内参质粒共转入RAW264.7，B16F10细胞，并用optiMEM 10%，DMEM完全培养基90%对瞬时转染的细胞进行培养。24 h后更换成DMEM+10%FBS完全培养基，加药处理。
1.2.5 荧光素酶活性测定按照双荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法检测在重组细胞RAW264.7细胞中pGL-3-TNF-α 3′UTR的荧光素酶的活性。用只含 PBS 的孔将荧光检测仪校准，测量萤火虫荧光素酶活性(Rn)和海肾素荧光素酶活性(Ff)，以萤火虫荧光素酶活性/海肾素荧光素酶活性(Rn/Ff)的值作为荧光素酶活性。以只转染空载体的RAW264.7细胞作为对照，并将该组的荧光素酶活性值进行归一化，转染pGL-3-TNF-α 3′UTR质粒组的荧光素酶活性为其相对值。
1.2.6 Western blot检测TNF-α蛋白表达水平药物处理12h的B16F10细胞，采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白，-80℃冰箱过夜后对每个样本进行蛋白定量，确定蛋白上样量。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭，TBST清洗，一抗孵育4℃过夜，室温孵育羊抗兔二抗1 h。免疫反应的条带使用相应的化学发光试剂(Perkin-Elmer Life Science,Boston,MA,USA)显色，凝胶成像系统(美国Bio-Rad，型号：GelDoc 2000)成像。
1.2.7 统计学分析采用graphpad 5.0软件进行单因素方差分析，样本均数间的比较采用LSD-t检验。结果以
± s表示。
利用PCR技术扩增 TNF-α 3′UTR为799kb，琼脂糖凝胶电泳显示出的PCR产物片段大小符合(Fig1)。挑取酶切鉴定正确的PGL3-TNF-α 3′UTR克隆进行测序。质粒序列与Genbank报道一致，证明目的基因已成功转入PGL3-Control载体中。
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| Fig 1 The TNF-α 3′UTR fragments amplification from cDNA of HUVEC cells The molecular weight of obtained fragments is 799bp. |
将所构建的质粒pGL3-TNF 3′UTR，pGL3-Control空载分别与pSVRenilla luciferase质粒组成双荧光素酶报告系统转染到RAW264.7细胞。脂多糖(lipopolysacchar-ides,LPS)可以诱导TNF-α的表达和分泌，pGL3-TNF 3′UTR报告系统转染组和空载对照组分别用终浓度为10 μg·L-1的LPS或者等体积的PBS刺激1 h，进行荧光素酶报告基因活性检测。给予LPS后可以明显增加TNF-α报告基因的表达，但是对空载对照的报告基因的表达没有明显影响(Fig2)。
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| Fig 2 Increased expression of TNF-α-3′UTR luciferase activity by LPS in RAW264.7 cells **P＜0.01 vs TNF-α-3′UTR(PBS). |
将构建的pGL3-TNF-α3′UTR质粒、pGL3-Control质粒与内参质粒pSVRenilla luciferase共转染入RAW264.7细胞，24 h后分别给予10 μmol·L-1[13]浓度的隐丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ，作用2 h，再加入LPS(10 μg·L-1)刺激1 h后[14]，分别检测 firefly/Renilla luciferase activity。结果显示，只有隐丹参酮在10 μmol·L-1可以明显抑制firefly/Renilla luciferase activity(Fig3A)。并且隐丹参酮可以剂量依赖性地抑制firefly/Renilla luciferase activity(Fig3B)。
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| Fig 3 Inhibition of the ratio of firefly/renilla luciferase activity induced by LPS A: Tanshinone compounds screening based on the TNF-α-3′UTR luciferase activity in RAW264.7 cells. **P＜0.01 vs LPS; B: Dose-dependent inhibition of TNF-α-3′UTR luciferase activity by cryptotanshinone. **P＜0.01 vs 0(LPS) |
小鼠黑色素瘤细胞B16F10自然高表达TNF-α，隐丹参酮可剂量依赖性地抑制B16F10的firefly/Renilla luciferase activity(Fig4A)。采用Western blot 法进一步对TNF-α蛋白水平进行分析，结果显示TNF-α蛋白与其对应的firefly/Renilla luciferase activity相一致，受到隐丹参酮的剂量依赖性抑制(Fig4B)。
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| Fig 4 Inhibition of TNF-αexpression by cryptotanshinone A:Dose-dependent inhibition of TNF-α-3′UTR luciferase activity by cryptotanshinone in B16F10 cells. **P＜0.01 vs 0; B:Protein expression of TNF-α in B16F10 cells to reduce by cryptotanshinone (detected by western blot). |
大量研究表明，由巨噬细胞分泌的细胞因 子——TNF-α既参与了免疫调节和介导炎症反应，同时也与多种肿瘤如乳腺癌[15]、骨髓瘤[16]等的发生发展密切相关。研究发现，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的炎性细胞分泌的TNF-α能够促进肿瘤的血管生成，进而维持肿瘤的生长及恶性演进。与此同时，临床上广泛应用的以TNF-α为靶标的药物，如沙利度胺[17]、英昔单抗[18]等，也是通过抑制肿瘤血管生成从而发挥抗肿瘤的效应。
转录后调控是指在基因转录起始后对转录产物进行的一系列加工和修饰的过程，通常位于成熟mRNA 的 5′ 或 3′ 端非翻译区(UTR)的特异序列与相应蛋白相互作用，介导mRNA的出核转运、胞质中的定位、翻译起始以及mRNA的降解，于转录后水平调控基因的表达水平[19]。TNF-α mRNA 的 3′UTR富含AU元件(AREs)，可通过ARE介导的降解途径调控TNF-α mRNA 的稳定性[20]。基于此，构建了包含TNF-α 3′UTR全长(878-1676片段)的荧光素酶报告基因质粒，并对其进行鉴定和活性检测。并与Renilla luciferase 质粒共转构成双荧光素酶报告基因系统，基于该报告基因系统在单核巨噬细胞RAW264.7上，对本实验室所研究的丹参酮类化合物从影响TNF-α转录后调节环节进行筛选。实验结果表明，丹参中四种脂溶性成分隐丹参酮、隐丹参酮I、丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡB，只有隐丹参酮可以明显抑制所构建的TNF-α 3′-UTR 双荧光素酶报告基因系统的荧光素酶活性，即隐丹参酮可以在转录后水平对TNF-α 基因表达进行调控。但是，由于TNF-α 3′UTR的调控元件众多，因此，本实验室将进一步研究隐丹参酮对TNF-α转录后调控的直接靶点。
本研究所构建的pGL-3-TNF-α 3′UTR质粒，可以用于研究药物对TNF-α具体的转录调控作用机制，同时利用该双荧光素酶报告基因系统筛选活血化瘀中药中其他活性成分，以期发现中药中以TNF-α为靶点的潜在抗肿瘤活性成分，为天然抗肿瘤药物的发现提供有效的研究平台。
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