磷酸化蛋白50[ezrin/radixin/moesin (ERM)-binding phosphoprotein 50，EBP50]是一个多功能连接蛋白，可以通过PDZ-1结构域、PDZ-2结构域及EB结构域与其他蛋白相互结合，参与细胞的多种生物活动。近年来的研究表明，EBP50的表达与乳腺癌的增殖和转移密切相关。EBP50在乳腺癌细胞MDA-MB-231中含量较低，而在乳腺癌细胞MCF-7中表达较高[1]；上调EBP50的表达可以降低乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力[2]。而一项针对222例乳腺癌患者的研究表明，EBP50的低表达可导致患者存活率降低[3]。以上的文献说明，在乳腺癌中，EBP50具有潜在的抗肿瘤能力，但抗肿瘤能力并未在上皮样乳腺癌细胞MCF-7细胞中得到验证。
有丝分裂原激活激酶(mitogen-activated kinase，MAPK)信号通路在多个物种中高度保守，是重要的细胞增殖与分化的调节信号通路。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是MAPK信号通路中的主要作用分子，参与并调控多种肿瘤的发生发展进程[4]。ERK持续活化可以促进信号传导与转录活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT1)降解，从而抑制其促凋亡、抗肿瘤能力[5]。
在本研究中，我们构建了稳定干扰EBP50表达的乳腺癌MCF-7细胞株，并对其增殖能力及潜在作用机制进行探讨。我们发现，EBP50可以抑制上皮样乳腺癌细胞MCF-7的增殖，这种抑制增殖的能力可能是通过抑制ERK1/2的活性实现的。本研究补充了EBP50抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制研究，为研究乳腺癌发生机制提供了一定的理论依据。
1 材料 1.1 实验细胞乳腺癌MCF-7细胞购于中国医学科学基础医学研究所细胞培养中心。MCF-7细胞使用 DMEM培养基，10% FBS培养。每隔2 d传代1次，细胞培养条件为 37 ℃，5% CO2。
1.2 主要试剂DMEM细胞培养基、进口血清FBS和胰酶购于美国Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；真核表达载体pGPU6/Neo为本实验室保存载体；磺酰罗丹明B试剂盒购于美国Sigma公司；抗人β-actin、EBP50、p-ERK1/2及ERK1/2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度定量试剂盒购于碧云天生物科技研究所。
2 方法 2.1 稳定干扰EBP50表达载体构建实验方法参考文献所示[6]，在线设计针对 EBP50的siRNA序列，逆转录合成有效靶序列的DNA，合成序列为：5′-CACCGACCAGAAACGCAGCAGCAAACTTCAAGAGA GTTTGCTGTGGTTTTTTTG-3′。将合成的小片段DNA经酶切后与载体pGPU6/Neo相连接，用于构建稳定干扰EBP50的稳转细胞系。
2.2 稳定干扰EBP50细胞系的建立实验方法参考文献[6]，具体步骤如下：预先在培养皿中培养细胞，使细胞在贴壁24 h后处于指数生长期。将构建好的载体经大提质粒试剂盒提纯后，使用Lipofectamine 2000转染试剂转染进入细胞中，待转染后24 h更换为含有真核筛选抗性的培养基。培养约2周后，将细胞消化、重悬，经梯度稀释后接种于96孔板中，继续培养。当细胞在培养孔中形成单克隆集落时，转移至48孔板中扩大培养。
2.3 Western blot取适量培养细胞，加入RIPA裂解液后振荡混匀，冰上放置30 min，间或振荡；4 ℃、4 560×g，离心15 min。取上清，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，其具体步骤参照说明书进行。调节蛋白至相同浓度，分装，加入5倍上样缓冲液，96 ℃变性10 min，用于SDS电泳；使用Amersham显色系统显色，经Western blot分析软件测出各条带的光密度值并分析[6]。
2.4 磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)法检测细胞增殖实验参考文献方法[7]，具体步骤如下：在每孔加入50 μL 4℃预冷的TCA溶液固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出，用去离子水冲洗5遍，室温晾干。待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%的SRB染液70 μL，染色30 min后倒掉染液，用1%乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。用100 μL非缓冲Tris-base碱液溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20 min，采用酶标仪540 nm处测定光吸收值。
2.5 统计学处理实验结果以
± s表示，两样本均数间比较采用t检验。
将合成的小片段DNA经酶切后与载体pGPU6/Neo相连接，转化进大肠杆菌DH5α中进行扩增。然后分别提纯空载体Mock以及sh-EBP50质粒，进行测序，结果如下图所示(Fig1A)，经DNA-MAN软件比对后证明测序结果正确(Fig1B)，说明载体构建成功。
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| Fig 1 Construction of sh-EBP50 plasmid A: The sequencing results of sh-EBP50 plasmid; B: The comparison results of sh-EBP50 plasmid with application of DNA-MAN. |
在稳定干扰EBP50细胞株形成的单克隆细胞中，挑选6个克隆细胞检测其EBP50的蛋白表达水平，以确定其干扰效果。使用空载体Mock组作为空白对照，实验结果显示，与Mock组相比，单克隆A1、A2、A3、B1、B2以及B3细胞株中的EBP50表达有所降低，其中A3以及B3中EBP50表达的降低差异具有显著性(P＜0.01)，而A1及 B1中EBP50的降低差异具有显著性(P＜0.01)，上述结果说明单克隆A1、A3、B1以及B3细胞株是可以稳定干扰EBP50表达的乳腺癌细胞株(Fig2)。在后续的研究中，我们选择A1细胞株作为研究对象(简称为sh-EBP50)。
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Fig 2
Screening and identification of sh-EBP50 breast cancer cells ( ± s, n=3)
A and B: The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of EBP50 was detected by Western blot. **P＜0.01 vs Mock.
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研究表明，EBP50与乳腺癌的增殖密切相关，上调EBP50的表达可以降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖能力[1]。因此，我们检测了敲除EBP50后对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响。使用SRB实验结果显示，敲除EBP50(Fig3A)可以明显地促进乳腺癌细胞的增殖能力(Fig3B)；而Western blot实验显示，敲除EBP50可以促进增殖信号标志分子c-myc的表达(Fig3C)。以上的实验结果显示，在乳腺癌MCF-7细胞中敲除EBP50可以促进其增殖能力。
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Fig 3
Silencing EBP50 promotes proliferation of breast cancer in MCF-7 cell line ( ± s, n=3)
A: The expression of EBP50 was reduced through stably transfecting the sh-EBP50 plasmid. The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of EBP50 was detected by Western blot; B: Silencing EBP50 promotes the proliferation of breast cancer in MCF-7 cell line. The proliferation of sh-EBP50 cells was detected by SRB assay; C: Silencing EBP50 increases the expression of c-myc. The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of c-myc was detected by Western blot. **P＜0.01 vs Mock.
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ERK包括ERK1与ERK2两种亚型，均可参与并调控多种肿瘤的发生发展进程[4]。在本研究中，干扰EBP50表达后可以上调ERK1和ERK2激酶的磷酸化水平，同时不影响ERK1和ERK2激酶原型的蛋白表达量(Fig4)，上述实验结果说明，敲除EBP50可以激活乳腺癌中ERK1/2的活性。
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Fig 4
Silencing EBP50 stimulates phosphorylation of ERK1/2 in MFC-7 breast cancer cell( ± s, n=3)
The MCF-7 cells were stably transfected with sh-EBP50 plasmid. The expression of phosphorylation of ERK1/2 and ERK1/2 was detected by Western blot. **P＜0.01 vs Mock.
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大量研究表明，EBP50参与了乳腺癌的增殖和转移。上调EBP50的表达可以降低乳腺癌细胞的侵袭能力，敲除EBP50可以促进T47D细胞的增殖[2]。此外，EBP50缺失还可以诱导上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[8]。而在原发性乳腺癌以及乳腺癌细胞系MDA-MD-231中，EBP50基因发生错义突变[2]。本研究中，我们发现了敲除EBP50可以促进MCF-7细胞增殖，本文的研究结果与上述文献报道相符，本研究补充了EBP50抑制乳腺癌增殖的研究。此外，也有文献表明，EBP50具有一定的促进肿瘤细胞生长与转移的能力。在胃癌细胞中，EBP50在胞质和胞核中均高表达，其表达量与肿瘤的大小呈正相关[9]。在肝细胞癌中，EBP50主要分布于细胞核中，并且可以促进肝细胞癌的生长[10]。在肾细胞癌中，EBP50可以与Ezrin结合形成蛋白质复合物，通过激活Rac1-ARHGEF7信号通路，促进肾细胞癌转移过程[11]。上述文献表明，EBP50对于肿瘤的调控作用具有组织差异性，在乳腺癌中，EBP50主要发挥抑制肿瘤生长和转移的作用，提示EBP50可以作为研究治疗乳腺癌发生发展机制的特异性靶点。
myc基因家族是较早发现的一组癌基因，包括c-myc、n-myc、l-myc。myc基因家族及其产物可促进细胞增殖、永生化、去分化和转化，因而在多种肿瘤形成过程中处于重要地位；而c-myc参与了多种乳腺癌的发生发展进程。肿瘤抑制因子(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)可以抑制c-myc的转录活性以及其转化活性，当BRCA1缺失可以导致c-myc的过量表达，从而诱导乳腺癌的发生[12]。此外，c-myc还是雌激素受体(estrogen receptor，ER)以及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路的下游效应分子，因而c-myc的高表达还是导致乳腺癌对辅助治疗发生耐受的重要原因[13]。上述文献表明，c-myc是乳腺癌细胞增殖过程中重要的生物学标志物，直接反映了乳腺癌细胞的增殖能力，因此在本研究中，我们除了使用SRB染色方式评价乳腺癌细胞的细胞活力以外，还检测了c-myc的蛋白表达量，共同评价EBP50缺失后对乳腺癌细胞增殖能力的影响。
EBP50还参与了其他多种分子介导的肿瘤增殖过程，例如EGFR[14]、Ⅱ型神经纤维瘤分子(neurofibromatosisⅡ，NF2)[15]、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)[16]等。当EGF刺激激活EGFR诱导MDA-MD-231细胞增殖，过量表达EBP50可以抑制ERK的激酶活性从而抑制MDA-MD-231细胞的增殖[4]，说明EBP50的抑制肿瘤作用可能是通过抑制ERK信号通路实现。此外，抑制ERK还可以降低肿瘤细胞的集落形成[17]，然而上调EBP50的表达可以通过抑制ERK的激酶活性，降低肿瘤细胞的集落形成[4]。上述研究表明，上调EBP50的表达可以通过降低ERK的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖与集落形成。在本研究中，我们发现EBP50缺失后可以促进乳腺癌的增殖，同时上调ERK1/2的磷酸化水平，我们的实验结果从EBP50缺失的角度证明了EBP50可以通过抑制ERK的活性，继而影响乳腺癌细胞的增殖，补充了EBP50对ERK活性调节的关系，及其对乳腺癌细胞增殖的影响。
综上所述，本研究通过构建稳定干扰EBP50表达的MCF-7乳腺癌细胞株，探讨EBP50对乳腺癌增殖的影响及潜在的机制。本研究的结果说明，EBP50可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力，这可能是通过抑制ERK1/2的活性实现的。本研究补充了EBP50抑制乳腺癌增殖的研究，为阐明乳腺癌的发生发展机制提供了一定的指导意义。
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