肺腺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要亚型，约占所有肺癌的40%^[1]，超过50%的晚期患者在接受一线靶向治疗后1~2年内出现耐药^[2-3]，5年生存率仅约15%^[4]。肿瘤异质性、耐药机制复杂及治疗方案局限成为制约疗效提升的关键问题^[5]。患者来源肿瘤样细胞簇（patient-derived tumor-like cell cluster，PTC）技术通过原代培养患者的肿瘤组织，构建保留原发肿瘤生物学特征和微环境的三维细胞模型，为精准评估药物敏感性、解析耐药机制提供了活体平台^[6]。目前PTC技术在肺腺癌中的应用尚处于探索阶段，其与基因检测结果的一致性、对临床疗效的预测价值仍需更多临床数据验证。本研究通过分析5例肺腺癌患者的基因检测结果与PTC药物敏感性检测数据，探讨PTC技术在精准医疗中的实际应用价值，旨在验证其对基因检测指导靶向治疗的补充作用，为个体化治疗方案的制定提供新的证据。

1 材料与方法 1.1 研究对象

收集2024年1月1日至6月30日间中国医科大学附属第一医院胸外科收治的5例肺腺癌患者的肿瘤组织样本及临床病理信息。纳入标准：经病理组织学确诊为肺腺癌（根据世界卫生组织2021肺癌分类标准）；临床分期为ⅢB~Ⅳ期或术后复发转移患者，具有可获取的肿瘤组织样本（CT引导下肺穿刺活检）；未接受过系统性抗肿瘤治疗（靶向治疗、化疗、免疫治疗）或停药≥4周；患者或家属签署知情同意书，自愿参与本研究。排除标准：样本量不足（肿瘤组织 < 50 mg）或严重坏死；合并其他恶性肿瘤或严重心、肝、肾功能障碍；拒绝提供随访数据。本研究经中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准（AF-SOP-07-1.2-01），所有患者签署知情同意书。

1.2 样本收集与处理

1.2.1 肿瘤组织获取

经CT引导下肺穿刺活检获取3~5条肿瘤组织（直径≥1 mm），直接转移至含培养基的离心管中，避免干燥。

1.2.2 样本处理

组织块经PBS洗涤2次后，加入含0.25%胶原酶Ⅳ（美国Sigma公司）和0.1%透明质酸酶（瑞士Roche公司）的消化液，37 ℃振荡孵育45 min，经70 μm细胞筛网过滤，1 500 r/min离心5 min，收集单细胞悬液。台盼蓝染色计数活细胞，确保细胞存活率 > 80%。

1.3 基因检测

1.3.1 基因组DNA提取

采用QIAamp DNA Mini Kit（德国Qiagen公司）提取肿瘤组织及PTC细胞基因组DNA，用Nanodrop 2000（美国ThermoFisher Scientific公司）测定浓度（A260/280=1.8~2.0），经Qubit 4.0荧光定量仪定量（> 100 ng/μL）。

1.3.2 靶向高通量测序（next generation sequencing，NGS）

使用SureSelect XT Human All Exon V7试剂盒（美国Agilent公司）捕获全外显子区域，基于Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序，目标测序深度≥1 000×。数据经BWA-MEM比对至hg38参考基因组，Genome Analysis Toolkit 4.2基因组分析工具包进行变异检测，筛选肺癌相关驱动基因（EGFR、ALK、MET、BRAF、RET、NTRK1等）的点突变、插入缺失、融合及拷贝数变异。

1.3.3 突变解读

依据美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）NSCLC指南（2024版）、世界卫生组织分子病理标准及Onco-KB数据库（https://www.oncokb.org/），判定突变临床意义。驱动基因突变定义为经美国食品药品监督管理局/欧洲药品管理局批准靶向药物对应的致病性变异（如EGFR 19Del、ALK融合），伴随突变定义为可能影响疗效或预后的变异（如TP53、KRAS突变）。

1.4 PTC培养与鉴定

1.4.1 原代细胞培养

采用无血清培养基Advanced DMEM/F12（美国Gibco公司），添加10 mmol/L HEPES、1×N2 Supplement、2×B27 Supplement（不含维生素A，美国Gibco公司）、50 ng/mL Noggin（美国PeproTech公司）、100 ng/mL RSPO1（美国PeproTech公司）、50 ng/mL表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）（美国PeproTech公司）及1%青霉素-链霉素。单细胞悬液以2×10⁴/孔接种于超低吸附96孔板（美国Cor-ning公司），于37 ℃、5%CO₂培养箱培养，每48 h换液1次，培养7~14 d，至形成直径50~200 μm的PTC。

1.4.2 PTC鉴定

（1）形态学观察，倒置相差显微镜下每日观察PTC形态，记录生长速度、三维结构特征（如不规则形、上皮样、核仁特征）。（2）免疫荧光染色，PTC经4% 多聚甲醛固定后，依次孵育上皮标志物抗体（CK7，1∶200，英国abcam公司）、间质标志物抗体（Vimentin，1∶100，美国CST公司）及DAPI染核，荧光显微镜下观察细胞表型。

1.5 药物敏感性测试

1.5.1 药物处理

选取临床常用靶向药物及对照药物（顺铂、紫杉醇），溶于DMSO，配制成10 mmol/L母液，实验浓度设为5个对数梯度（如10^-6~10^-2 μmol/L），每个浓度设3个复孔。取对数生长期PTC（约50个细胞簇/孔）接种于96孔板，加入含药物的培养基，37 ℃孵育72 h。

1.5.2 细胞活力检测

采用CCK-8法检测细胞活力。每孔加入10 μL CCK-8溶液（日本Dojindo公司），孵育2 h后，酶标仪测定450 nm吸光度（optical density，OD）。细胞存活率（%）=（药物组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100。通过Graph Pad Prism 9拟合剂量-反应曲线，计算半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀），定义IC₅₀ < 1 μmol/L为敏感，IC₅₀≥1 μmol/L为耐药。

1.6 统计学分析

将基因检测结果（驱动基因、伴随突变）、PTC形态学特征（细胞簇形态、核仁分级）及药物敏感性数据（IC₅₀值、敏感药物）录入Excel数据库，建立患者个体化档案。采用Kappa系数评估基因检测推荐药物与PTC药物敏感性结果的一致性（Kappa > 0.75为高度一致，0.4~0.75为中度一致，< 0.4为低度一致）。

2 结果 2.1 患者基线特征及基因检测结果

共纳入5例ⅢB~Ⅳ期肺腺癌患者，其中男3例，女2例，年龄48~65岁（中位年龄56岁）。病理类型均为原发性肺腺癌。经CT引导下肺穿刺活检，所有样本均经病理确认肿瘤细胞占比 > 50%，细胞存活率 > 80%。

5例患者均检测到明确驱动基因突变，涵盖EGFR、ALK、MET、BRAF、RET等肺癌常见靶点。患者1，EGFR基因19外显子缺失（19Del，VAF=72%），伴随TP53基因p.R273H错义突变（VAF=45%）。患者2，ALK基因E6：ALK融合（EML4-ALK v3型），伴随KRAS基因G12C突变（VAF=38%）。患者3，MET基因14外显子跳跃突变（c.3091-1G > A），伴随ERBB2基因p.V659E错义突变（VAF=22%）。患者4，BRAF基因V600E突变（VAF=68%），伴随NRAS基因Q61R突变（VAF=35%）。患者5，RET基因KIF5B-RET融合（exon12：exon10），伴随NTRK1基因E6：ETV6融合（VAF=18%）。见表 1。

2.2 PTC培养与鉴定结果

5例患者肿瘤组织均成功培养PTC，培养成功率为100%，平均形成时间为（9.2±2.1）d。显微镜下观察到2种主要形态：（1）不规则形（患者1、4），细胞簇边界不清晰，细胞大小差异显著，核仁明显，提示高侵袭性表型；（2）上皮样形态（患者2、3、5），细胞排列紧密，呈腺泡状或铺路石样，核仁较均匀，保留腺癌细胞分化特征。见图 1。

2.3 药物敏感性测试结果

2.3.1 靶向药物敏感性

PTC对对应靶点药物均表现出敏感性（IC₅₀ < 1 μmol/L），对非靶向药物耐药（IC₅₀≥1 μmol/L）。患者1，吉非替尼敏感（IC₅₀=0.12 μmol/L），奥希替尼耐药（IC₅₀ > 10 μmol/L），顺铂耐药（IC₅₀=8.5 μmol/L）。患者2，克唑替尼敏感（IC₅₀=0.08 μmol/L），紫杉醇耐药（IC₅₀=5.2 μmol/L）。患者3，卡马替尼敏感（IC₅₀=0.05 μmol/L），曲妥珠单抗耐药（IC₅₀≥10 μmol/L，因未针对ERBB2突变单独用药）。患者4，维莫非尼敏感（IC₅₀=0.2 μmol/L），MEK抑制剂考比替尼敏感（IC₅₀=0.3 μmol/L，联合用药协同效应）。患者5，塞尔帕替尼敏感（IC₅₀=0.03 μmol/L），拉罗替尼敏感（IC₅₀=0.05 μmol/L，因NTRK融合同时存在）。

2.3.2 伴随突变对药物敏感性的影响

患者1的TP53突变与奥希替尼耐药相关（IC₅₀ > 10 μmol/L），而患者2的KRAS G12C突变未影响ALK抑制剂克唑替尼的敏感性（IC₅₀=0.08 μmol/L），提示伴随突变对药物反应的影响存在异质性。

2.4 基因检测结果与PTC药物敏感性结果的一致性分析

采用Kappa系数评估两者一致性，结果显示，Kappa=0.92（P < 0.001），表明基因检测推荐药物与PTC药物敏感性结果高度一致。5例患者中，基因检测提示的靶向药物在PTC模型中均表现为敏感，且PTC进一步揭示了第3代TKI耐药（患者1）及双靶点融合药物选择（患者5）的个体化差异。见表 2。

3 讨论

本研究通过5例肺腺癌患者的临床应用，系统展示了PTC技术在肺腺癌个体化诊疗中的三重优势。

3.1 基因检测的活体功能验证平台

基因检测虽能明确驱动基因突变，但无法直接反映药物对肿瘤细胞的实际杀伤效应。本研究中，患者1基因检测结果提示可选用第1代/第3代EGFR-TKI，但PTC药敏试验显示奥希替尼耐药（IC₅₀ > 10 μmol/L），与TP53 p.R273H突变介导的DNA损伤修复通路激活相关。这表明PTC技术可作为基因检测的“功能验证层”，避免单纯依赖基因型导致的治疗误判。患者5的NTRK1融合未对RET抑制剂产生交叉耐药，证实PTC能准确反映双靶点变异的药物兼容性，为罕见突变组合的治疗提供实证依据。

3.2 肿瘤异质性的体外映射模型

肺腺癌的高度异质性导致同一患者的不同病灶可能存在耐药亚克隆。本研究通过PTC形态学发现不规则形PTC（患者1、4）提示与高侵袭性表型相关。这种表型异质性在传统二维细胞培养中难以保留，而PTC技术通过三维培养体系成功模拟了肿瘤细胞的空间结构与功能亚群，为解析耐药机制（如上皮-间质转化介导的靶向耐药）提供了直观模型。

3.3 快速药物敏感性检测的临床实用价值

本研究中PTC培养成功率达100%，平均形成时间9.2 d，显著快于患者来源的异种移植模型（4~8周），且CCK-8法检测周期仅72 h，符合临床快速决策需求。5例患者的PTC药物敏感性结果与基因检测推荐药物高度一致（Kappa=0.92），尤其在伴随突变的影响评估中展现优势，患者2的KRAS G12C突变未削弱ALK抑制剂敏感性，提示靶向药物可绕过下游通路突变直接作用于融合蛋白，这一发现为复杂突变背景下的治疗选择提供了新视角。

此外，本研究结果有助于探索PTC技术与基因检测的协同诊疗模式。基因检测与PTC技术的联合应用构建了“分子分型-功能验证-方案优化”的精准医疗闭环。分子分型：NGS检测明确驱动基因（EGFR 19Del、ALK融合）及伴随突变（如TP53、KRAS），划定潜在靶向药物范围。功能验证：PTC药敏试验排除基因检测中的“潜在耐药”（如患者1的奥希替尼耐药），补充药物反应的表型证据。方案优化：基于PTC形态学特征（如核仁明显提示高增殖活性），可考虑联合周期特异性药物（如紫杉醇），形成“靶向+化疗”的个体化组合方案。这种模式尤其适用于罕见突变（如RET/NTRK双融合）和复杂突变（如BRAF V600E+NRAS Q61R）患者，通过PTC技术验证药物协同效应（如患者4的维莫非尼+考比替尼联合敏感），避免经验性用药的局限性。

本研究还探索了伴随突变对药物反应的异质性影响，结果发现，伴随突变对药物敏感性的影响存在显著差异。耐药相关突变：患者1的TP53 p.R273H突变与奥希替尼耐药直接相关，可能通过激活MDM2/p53信号通路降低第3代TKI的凋亡诱导效应，这与文献报道的TP53突变介导EGFR-TKI耐药机制一致。无显著影响突变：患者2的KRAS G12C突变未影响克唑替尼敏感性，推测ALK融合蛋白的强致癌依赖性可能抵消了KRAS通路激活的补偿效应，提示ALK抑制剂对融合基因的“驱动成瘾性”具有高度特异性。上述差异表明，伴随突变的临床意义需结合功能学验证，而非单纯依赖生物信息学预测。PTC技术通过保留原发肿瘤的突变背景与信号通路网络，为解析突变交互作用提供了独特平台。

3.4 转化研究方向

（1）技术优化：开发自动化PTC培养平台，将培养周期缩短至5~7 d，提升临床适用性；结合单细胞测序解析PTC内异质性细胞亚群，构建耐药预测模型。（2）临床扩展：开展多中心、前瞻性研究，验证PTC药物敏感性结果与临床疗效（如客观缓解率、无进展生存期）的相关性；探索胸腔积液、痰液等无创样本来源的PTC培养技术，降低样本获取创伤。（3）机制深挖：针对形态学-功能关联（如上皮样形态与EGFR表达的正相关性），解析细胞极性调控对靶向药物敏感性的影响，为开发新型增敏策略提供靶点。

本研究存在局限性：仅纳入5例患者，虽培养成功率达100%，但肺腺癌不同病理亚型（如微浸润腺癌、实性亚型）及耐药患者的PTC培养效率仍需大样本验证；微环境简化问题，当前PTC模型未包含肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞等基质成分，可能影响药物渗透与免疫调节相关药物敏感性结果，需开发共培养体系；长期培养稳定性，本研究仅验证了2周内的基因稳定性，传代次数对PTC生物学特征的影响（如耐药亚群富集）尚需进一步研究。

综上所述，本研究基于PTC技术通过整合基因层面的分子特征与表型层面的功能反应，为肺腺癌的精准治疗提供了“双重保险”。未来可构建PTC药物敏感性指导下的靶向治疗临床路径，对新诊断患者同步进行NGS检测与PTC培养，7~10 d内出具“基因型推荐+表型验证”的个体化方案，尤其适用于一线治疗失败、需二线药物筛选的患者。随着技术标准化与成本优化，PTC技术有望成为继基因检测之后精准医疗时代又一核心工具，推动肺腺癌治疗从“基于指南的群体治疗”向“基于个体的精准干预”跨越。