2026, Vol. 55文章信息
- 唐永军, 张煜华, 玉山江·朱玛合, 迪力木拉提·依斯热依力, 西合热扎提·阿布力米提
- TANG Yongjun, ZHANG Yuhua, Yushanjiang·ZHUMAHE, Dilimulati·YISIREYILI, Xiherezati·ABULIMITI
- 紫花牡荆素通过调节IL-10/STAT3信号通路减轻氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞损伤
- Effect of casticin on oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced brain microvascular endothelial cell injury by regulating IL-10/STAT3 signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2026, 55(5): 437-442
- Journal of China Medical University, 2026, 55(5): 437-442
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-18
- 网络出版时间：2026-05-18 15:32:54
引用本文 |
2. 新疆医科大学第二附属医院感染科, 乌鲁木齐 830011
2. Department of Infectious Disease, The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
脑卒中是一种危及生命的急性脑血管疾病，主要发生在老年人群。脑卒中大致可分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，临床上最常见的是缺血性脑卒中。缺血性脑卒中是大脑动脉阻塞导致大脑供血不足，引起脑组织缺氧和坏死[1]。脑卒中是全球第二大死亡原因[2]。急性缺血性脑卒中的一个标志是血脑屏障破坏，包括紧密连接和其他分子功能受损，以及血脑屏障通透性增加，导致脑水肿和一系列临床症状，其中血管内皮细胞在血脑屏障的调节作用中占主导地位[3]。紫花牡荆素是从多种植物中分离出来的一种主要生物活性类黄酮，主要来自牡荆属，具有抗炎和抗氧化特性[4]。已有研究[5]表明，紫花牡荆素可以改善东莨菪碱诱导的小鼠认知功能障碍。白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一种主要由脑内小胶质细胞和星形胶质细胞产生的抗炎细胞因子，IL-10受体广泛表达于各种细胞表面。脑出血患者的血清、外周血和血肿引流液中IL-10增加[6]。研究[7]表明，IL-10通过信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）促进内皮祖细胞浸润和伤口愈合。α-酮戊二酸通过Fos原癌基因蛋白/IL-10/STAT3信号通路减轻脑缺血再灌注损伤[8]。因此，本研究探讨了紫花牡荆素对氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）诱导的小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）损伤的影响，验证IL-10/STAT3通路在此过程中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞来源小鼠BMEC（PAMC-C117），购自苏州海星生物科技有限公司。采用小鼠BMEC完全培养基培养，培养条件为95%空气+5%CO2，温度37 ℃。
1.2 主要试剂紫花牡荆素（53186ES08）、MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒（40206ES80）、FITC-Dextran（61221），购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；IL-10抑制剂AS101（HY-101019，纯度≥98.0%），购自美国MCE公司；小鼠BMEC完全培养基（PAMC-G117），购自苏州海星生物科技有限公司；Hanks’平衡盐溶液（PB180323），购自武汉普诺赛生命科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（MA0220），购自大连美仑生物技术有限公司；STAT3单抗（ab68153）、p-STAT3单抗（ab76315）、GAPDH单抗（ab9485）、IL-10单抗（ab9969）、羊抗兔IgG二抗（ab97051），购自英国abcam公司。
1.3 实验方法 1.3.1 细胞分组和模型构建将BMEC分为对照组、OGD/R组、低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素+AS101组。对照组细胞在正常条件下培养[9]。除对照组外，其余组细胞均构建OGD/R模型。将BMEC在脱氧无葡萄糖的Hanks’平衡盐溶液中培养4 h，培养箱气体为5%CO2和95%N2，然后更换为正常培养基复氧24 h，培养箱气体为5%CO2和95%空气。OGD/R诱导完成后，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC分别用含2、4、8 μmol/L紫花牡荆素的培养基培养[10]，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC用含8 μmol/L紫花牡荆素和0.5 μg/mL AS101的培养基培养[11]，48 h后进行后续实验。
1.3.2 MTT检测细胞增殖将细胞接种于96孔板，加入10 μL MTT溶液，在37 ℃下培养4 h，随后每孔加入100 μL甲臜溶解液，混匀后放入37 ℃培养箱中孵育4 h。使用酶标仪检测570 nm处吸光度值。
1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，将BMEC用不含EDTA的胰酶消化，离心收集细胞后，重新悬浮在100 μL结合缓冲液中。向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀，室温避光孵育15 min。在收集细胞后1 h内，采用流式细胞仪检测凋亡细胞。
1.3.4 血管形成测定向24孔板中加入60 μL Matrigel基质，将细胞接种于24孔板中，孵育6 h。随机选择3个视野观察、拍照。使用ImageJ软件中的“血管生成分析仪”插件，分析血管长度。
1.3.5 跨内皮电阻（transendothelial electrical resis-tance，TEER）测量将细胞接种到12孔Transwell小室中，以单层形式培养。每隔2 h测量TEER值，直至测得的阻力稳定后，进行分组培养。Transwell小室内部和外部的培养基液位相同。建模和分组干预后，测量TEER。将校准的Millicell-ERS-2电极浸入70%乙醇中15 min，然后在空气中干燥5 s。用无菌电解质溶液清洗电极。电极的短端和长端浸入Transwell小室内外的培养基中，保持与液体表面的垂直度。最后，读取并记录数据。
1.3.6 内皮通透性检测将1 mg FITC葡聚糖溶于1 mL双蒸水中，得到浓度为1 mg/mL的储备液。用无血清培养基将储备液稀释至浓度为500 μg/mL的工作液。干预后，加入PBS洗涤2次。将100 μL FITC葡聚糖（500 μg/mL）加入到上室中，将600 μL无血清基础培养基添加到下室中。黑暗中孵育1 h后，从每个隔室中吸出100 μL培养基，上样到96孔板。使用多功能酶阅读器测量492 nm和520 nm处吸光度值，计算渗透率。
1.3.7 Western blotting检测IL-10和STAT3蛋白表达收集细胞样品，裂解提取蛋白，使用BCA方法测定蛋白质浓度。采用凝胶电泳分离蛋白质，进行膜转移，5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h。将膜在4 ℃下与IL-10、p-STAT3、STAT3和GAPDH一抗孵育过夜后，与二抗在室温下再孵育2 h。记录图像，使用ImageJ软件分析蛋白表达水平。
1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey多重检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组BMEC细胞活性比较与对照组比较，OGD/R组BMEC细胞活性降低（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC细胞活性升高（P < 0.05），且细胞活性呈剂量依赖性升高（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC细胞活性降低（P < 0.05）。见表 1。
| Group | n | Cell viability | Apoptosis rate（%） | Relative vascular length（%） | TEER（Ω·cm2） | Endothelial permeability |
| Control | 6 | 1.00±0.13 | 3.83±0.46 | 103.85±12.59 | 97.84±10.58 | 1.00±0.11 |
| OGD/R | 6 | 0.38±0.051） | 17.94±2.511） | 31.63±3.941） | 47.39±5.821） | 3.14±0.361） |
| Low-concentration casticin | 6 | 0.52±0.072） | 14.67±1.892） | 47.38±6.752） | 60.47±7.242） | 2.62±0.342） |
| Medium-concentration casticin | 6 | 0.69±0.082），3） | 11.12±1.472），3） | 65.86±7.922），3） | 74.12±8.742），3） | 2.03±0.252），3） |
| High-concentration casticin | 6 | 0.88±0.112），3），4） | 7.01±1.052），3），4） | 85.27±9.282），3），4） | 89.83±9.572），3），4） | 1.31±0.152），3），4） |
| High-concentration casticin+AS101 | 6 | 0.47±0.065） | 16.68±1.845） | 38.49±5.215） | 52.94±6.095） | 2.98±0.385） |
| F | 36.386 | 67.403 | 72.742 | 37.085 | 58.094 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OGD/R group；3）P < 0.05 vs. low-concentration casticin group；4）P < 0.05 vs. medium-concentration casticin group；5）P < 0.05 vs. high-concentration casticin group. | ||||||
2.2 各组BMEC凋亡率比较
与对照组比较，OGD/R组BMEC凋亡率升高（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC凋亡率降低（P < 0.05），且凋亡率呈剂量依赖性降低（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC凋亡率升高（P < 0.05）。见表 1、图 1。
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| A, control group; B, OGD/R group; C, low-concentration casticin group; D, medium-concentration casticin group; E, high-concentration casticin group; F, high-concentration casticin + AS101 group. 图 1 各组BMEC流式细胞图 Fig.1 Flow cytometry of BMECs in each group |
2.3 各组BMEC血管形成测定
与对照组比较，OGD/R组BMEC管状结构形成减少（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC管状结构形成增加（P < 0.05），且管状结构形成长度呈剂量依赖性增加（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC管状结构形成减少（P < 0.05）。见表 1、图 2。
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| 图 2 各组BMEC血管形成的比较×100 Fig.2 Comparison of blood vessel formation in BMECs among the groups ×100 |
2.4 各组BMEC内皮单层的TEER
与对照组比较，OGD/R组BMEC内皮单层的TEER降低（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC内皮单层的TEER升高（P < 0.05），且TEER呈剂量依赖性升高（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC内皮单层的TEER降低（P < 0.05）。见表 1。
2.5 各组BMEC内皮通透性的比较与对照组比较，OGD/R组BMEC内皮通透性升高（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组、高浓度紫花牡荆素组BMEC内皮通透性降低（P < 0.05），且内皮通透性呈剂量依赖性降低（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC内皮通透性升高（P < 0.05）。见表 1。
2.6 各组BMEC中IL-10和STAT3蛋白表达的比较与对照组比较，OGD/R组BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白表达水平降低（P < 0.05）；与OGD/R组比较，低浓度紫花牡荆素组、中浓度紫花牡荆素组和高浓度紫花牡荆素组BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白表达水平升高（P < 0.05），且蛋白表达水平呈剂量依赖性升高（P < 0.05）；与高浓度紫花牡荆素组比较，高浓度紫花牡荆素+AS101组BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白表达水平降低（P < 0.05）。见表 2、图 3。
| Group | n | IL-10/GAPDH | p-STAT3/STAT3 |
| Control | 6 | 1.05±0.11 | 0.74±0.09 |
| OGD/R | 6 | 0.19±0.031） | 0.25±0.041） |
| Low-concentration casticin | 6 | 0.41±0.052） | 0.38±0.052） |
| Medium-concentration casticin | 6 | 0.66±0.082），3） | 0.53±0.072），3） |
| High-concentration casticin | 6 | 0.93±0.112），3），4） | 0.71±0.082），3），4） |
| High-concentration casticin+AS101 | 6 | 0.26±0.045） | 0.31±0.045） |
| F | 128.049 | 61.539 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OGD/R group；3）P < 0.05 vs. low-concentration casticin group；4）P < 0.05 vs. medium-concentration casticin group；5）P < 0.05 vs. high-concentration casticin group. | |||
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| 1, control group; 2, OGD/R group; 3, low-concentration casticin group; 4, medium-concentration casticin group; 5, high-concentration casticin group; 6, high-concentration casticin+AS101 group. 图 3 Western blotting检测BMEC中IL-10、p-STAT3和STAT3蛋白表达 Fig.3 Expression of IL-10, p-STAT3, and STAT3 proteins in BMECs detected by Western blotting |
3 讨论
BMEC对于向神经元输送足够的氧气和营养至关重要，其具有清除有毒代谢物、维持血脑屏障以及物质、激素和代谢物跨内皮转运等作用，而血脑屏障的破坏对脑卒中和认知障碍有重要影响[12]。
紫花牡荆素具有广泛的治疗特性，包括镇痛、抗炎、抗血管生成、平喘和抗肿瘤活性，可通过不同的信号通路（包括STAT3）发挥作用[13]。研究[10]表明，紫花牡荆素通过抑制Toll样受体4/核因子κB通路，避免大鼠大脑中动脉闭塞后的神经元损伤，改善神经功能。紫花牡荆素可以通过激活环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号通路减轻OGD/R诱导的神经元损伤。本研究应用紫花牡荆素处理OGD/R诱导的BMEC，结果发现，紫花牡荆素可以提高BMEC细胞活性和TEER，抑制细胞凋亡，促进血管形成，降低内皮通透性，且随浓度的升高而作用加强。本研究结果提示，紫花牡荆素能够减轻OGD/R诱导的BMEC损伤，与之前研究[10]报道的紫花牡荆素减轻OGD/R诱导的神经元损伤的结果一致，表明紫花牡荆素可能作为脑卒中的潜在治疗药物。
IL-10具有很强的免疫抑制活性，与缺血性卒中的发生风险总体上无显著关联，但与大血管疾病和微血管疾病相关。研究[14]报道，在卒中实验中，IL-10mRNA和蛋白以及IL-10R mRNA水平升高，在过表达IL-10的转基因小鼠中，缺血性脑卒中4 d后脑梗死面积减小，细胞凋亡受限制。毛蕊花糖苷通过调节IL-10/STAT3信号传导，保护小鼠BMEC免受OGD/R诱导的损伤[15]。因此，本研究检测了不同处理后BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白的表达，结果表明，OGD/R诱导的BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白表达水平较对照组降低；不同浓度的紫花牡荆素均能提高BMEC中IL-10和p-STAT3蛋白表达水平，且随紫花牡荆素浓度升高，蛋白表达水平升高；然而，IL-10抑制剂AS101能够通过抑制IL-10，消除STAT3磷酸化，削弱紫花牡荆素对OGD/R诱导的BMEC损伤的治疗作用。表明紫花牡荆素减轻OGD/R诱导的BMEC损伤，可能是通过促进IL-10/STAT3通路来实现。
综上所述，紫花牡荆素可能通过促进IL-10/STAT3信号通路减轻OGD/R诱导的BMEC损伤。本研究采用细胞模型对紫花牡荆素治疗脑卒中进行了验证，但未进行动物实验验证，后续可对此进行深入研究。
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