肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期症状隐匿，多数患者在确诊时已发展为局部晚期肿瘤或出现远端转移^[1-2]。分子靶向药物是晚期HCC患者的主要治疗手段^[2-3]。乐伐替尼是一种多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，属于HCC一线靶向药物^[4]。然而，HCC患者对乐伐替尼耐药的现象越来越常见^[5]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m⁶A）甲基化是一种真核生物常见的RNA修饰方法。RNA m⁶A甲基化对RNA代谢的调控异常与人类恶性肿瘤耐药有关^[6]。有研究^[7]显示，m⁶A甲基化修饰在HCC靶向药物耐药细胞中上调，抑制相关基因的m⁶A甲基化水平可提高细胞的药物敏感性。隐花色素蛋白2（cryptochrome 2，Cry2）是生物钟基因家族的核心成员之一^[8]，其在HCC组织中的表达下调，并与患者的低生存率相关^[9]。过表达Cry2可抑制HCC细胞HepG2的增殖^[10]。然而，Cry2是否参与调节HCC靶向药耐药尚不明确。因此，本研究旨在探讨Cry2的m⁶A甲基化水平与HCC乐伐替尼耐药细胞药物敏感性之间的关系，以期为临床HCC患者克服乐伐替尼耐药问题提供潜在治疗靶点。

1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂

人HCC细胞系Huh-7购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心；乐伐替尼耐药细胞株（lenvatinib resistance Huh-7，Huh-7/LR）购自中国典型培养物保藏中心。乐伐替尼（美国Med Chem Express公司），DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），噻唑蓝（methyl thiazol tetrazolium，MTT）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司），EpiQuik m⁶A RNA Methylation Quantification Kit（美国Epigentek公司），m⁶A甲基化RNA免疫沉淀试剂盒（广州锐博生物技术有限公司），逆转录试剂盒、qPCR SYBR Green Master Mix [翌圣生物科技（上海）股份有限公司]，兔抗人Cry2抗体、兔抗人甲基转移酶样蛋白（methyltransferase-like protein，METTL）3抗体、兔抗人METTL14抗体、兔抗人Wilms瘤1相关蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）抗体、兔抗人病毒样m⁶A相关甲基转移酶（vir like m⁶A methyltransferase associated，VIRMA）抗体、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（英国abcam公司）。Cry2干扰质粒（si-Cry2）和过表达质粒（oe-Cry2）、METTL3干扰质粒（si-METTL3）和过表达质粒（oe-METTL3）以及对应阴性对照质粒均由上海吉玛制药技术有限公司提供。

1.2 细胞转染及分组

采用含10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养Huh-7细胞和Huh-7/LR细胞。转染前，将Huh-7/LR细胞接种于6孔细胞培养板中培养至细胞汇合度达到75%左右，采用无血清培养基分别稀释质粒和lipofectamine 2000转染试剂，分别将si-Cry2、oe-Cry2、si-METTL3、oe-METTL3以及干扰阴性对照（si-NC）和过表达空载（Vector）质粒和转染试剂混合后，加入至细胞中混匀，将细胞分为Vector组、oe-Cry2组、oe-METTL3组、si-NC组、si-METTL3组、si-Cry2组和si-Cry-2+si-METTL3组，另将未经转染的Huh-7/LR细胞设置为对照组。继续培养48 h后，采用实时定量PCR和Western blotting检测转染效率。

1.3 MTT

将细胞以3×10³/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，采用不同浓度（0、0.5、1、5、10、20、40、60、80 μmol/L）的乐伐替尼处理各组细胞48 h，随后加入10 μL MTT溶液避光孵育2 h，再加入100 μL二甲基亚砜低速震荡10 min，在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度（absorbance，A）值，计算细胞增殖抑制率、半数抑制浓度（50% inhibitor concentration，IC₅₀）和耐药指数（resistance index，RI）。细胞增殖抑制率（%）=（1-A_加药孔/A_不加药孔）×100，再根据细胞增殖抑制率计算IC₅₀值；RI=耐药细胞IC₅₀值/亲本细胞IC₅₀值。

1.4 流式细胞术

将细胞以1×10⁴/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，加入或不加入1 μmol/L乐伐替尼干预细胞48 h。收集细胞，加入200 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液避光孵育20 min，置于流式细胞仪中检测各组细胞凋亡率。

1.5 比色法

采用TRIzol提取细胞总RNA。根据试剂盒说明书操作，向检测孔中加入80 µL结合缓冲液和1 µL总RNA，混匀后于37 ℃中密封孵育90 min。利用试剂盒里的试剂设置阴性对照孔和阳性对照孔。洗涤细胞，依次加入50 μL捕获抗体和50 μL检测抗体进行孵育。再加入50 μL增强剂和100 μL显影剂显影。最后，在酶标仪上检测450 nm波长处的A值。RNA m⁶A甲基化水平（%）= [（A_样本孔-A_{阴性对照孔}）/200] / [（A_{阳性对照孔}-A_{阴性对照孔}）/2] ×100。

1.6 实时定量PCR

采用TRIzol提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。采用qPCR SYBR Green Master Mix进行扩增检测：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。引物序列如下：Cry2，正向5’-GACGTGGGTAAGAGATCCGC-3’，反向5’-ATG TAAGGGGTGGCTTCTGC-3’；METTL3，正向5’-AGATGGGGTAGAAAGCCTCCT-3’，反向5’-TGGTCAGCATAGGTTACAAGAGT-3’；GAPDH，正向5’-ACAACTTTGGTAT CGTGGAAGG-3’，反向5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算细胞中METTL3和Cry2 mRNA相对表达量。

1.7 甲基化RNA免疫沉淀法

根据试剂盒说明书操作，采用TRIzol提取各组细胞总RNA，随后进行片段化处理。采用抗m⁶A抗体制备抗m⁶A磁珠，与片段化的RNA充分混匀2 h。利用磁力架收集磁珠，然后洗脱和回收m⁶A甲基化富集的RNA溶液。最后采用实时定量PCR检测RNA溶液中Cry2 RNA m⁶A表达水平。

1.8 Western blotting

收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白。蛋白浓度测定后，SDS-PAGE电泳、转膜、封闭。将膜与一抗（METTL3、METTL14、WTAP和VIRMA抗体按照1∶1 000稀释，Cry2和GAPDH抗体按照1∶2 000稀释）于4 ℃中孵育过夜，再与二抗于室温中孵育1 h。在膜上滴加发光试剂于暗室中显影曝光。采用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行分析。符合正态分布的数据以x±s表示。2组比较采用独立样本t检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Cry2在Huh-7/LR细胞中低表达

随着乐伐替尼干预浓度的升高，Huh-7细胞和Huh-7/LR细胞的增殖率逐渐降低，在同一浓度乐伐替尼干预下，Huh-7/LR细胞的增殖率显著高于Huh-7细胞（P < 0.05，图 1A）。乐伐替尼处理Huh-7细胞的IC₅₀为6.301 μmol/L，乐伐替尼处理Huh-7/LR细胞的IC₅₀为39.822 μmol/L，Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的RI为6.320。与Huh-7细胞比较，Huh-7/LR细胞中Cry2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P < 0.01，图 1B、1C）。

2.2 Cry2过表达增强Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的敏感性

与对照组比较，oe-Cry2组Huh-7/LR细胞中Cry2 mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P < 0.01，图 2A、2B）。不同浓度乐伐替尼处理48 h，oe-Cry2组Huh-7/LR细胞IC₅₀值（16.907 μmol/L）较对照组（40.718 μmol/L）显著降低（图 2C）。在相同干预条件下，与对照组比较，oe-Cry2组Huh-7/LR细胞凋亡率显著升高（P < 0.01）。与0 µmol/L乐伐替尼干预的对照组比较，1 μmol/L乐伐替尼干预的对照组Huh-7/LR细胞凋亡率无显著变化（P > 0.05），而oe-Cry2组Huh-7/LR细胞凋亡率显著升高（P < 0.01，图 2D）。

2.3 Huh-7/LR细胞中m⁶A甲基化水平升高

与Huh-7细胞比较，Huh-7/LR细胞中RNA m⁶A甲基化水平（0.20±0.03 vs. 0.36±0.05）和m⁶A甲基转移酶METTL3蛋白表达水平显著升高（P < 0.01），而METTL14、WTAP和VIRMA等蛋白表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。

2.4 METTL3调控Huh-7/LR细胞中Cry2 m⁶A甲基化

与对照组比较，si-METTL3组Huh-7/LR细胞中METTL3 mRNA和蛋白表达水平及Cry2 m⁶A甲基化水平显著降低（P < 0.05），而Cry2 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P < 0.05），oe-METTL3组Huh-7/LR细胞中METTL3 mRNA和蛋白表达水平及Cry2 m⁶A甲基化水平显著升高（P < 0.01），而Cry2 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P < 0.05），见图 4。

2.5 沉默METTL3通过上调Cry2逆转Huh-7/LR细胞耐药

与si-NC组比较，si-METTL3组Huh-7/LR细胞中Cry2蛋白表达水平显著升高（P < 0.01），si-Cry2组Cry2蛋白表达水平显著降低（P < 0.01）；与si-METTL3组比较，si-METTL3+si-Cry2组细胞中Cry2蛋白表达水平显著降低（P < 0.01，图 5A）。随着乐伐替尼干预浓度的增加，Huh-7/LR细胞增殖率逐渐降低（图 5B）。与si-NC组（39.03 μmol/L）相比，si-METTL3组IC₅₀值（12.03 μmol/L）降低，si-Cry2组IC₅₀值（63.76 μmol/L）升高；与si-METTL3组相比，si-METTL3+si-Cry2组IC₅₀（53.67 μmol/L）升高。在相同乐伐替尼浓度处理条件下，与si-NC组比较，si-METTL3组细胞凋亡率显著升高（P < 0.01），si-Cry2组细胞凋亡率显著降低（P < 0.05）；与si-METTL3组比较，si-METTL3+si-Cry2组细胞凋亡率显著降低（P < 0.01）。与0 μmol/L乐伐替尼干预的相同组比较，1 μmol/L乐伐替尼干预后的si-METTL3组和si-METTL3+si-Cry2组Huh-7/LR细胞凋亡率显著升高（P < 0.01，图 5C）。

3 讨论

研究^[11]显示，Cry2在HCC组织和细胞中低表达，过表达Cry2可抑制HCC细胞的增殖和迁移。另有研究^[12]发现，在乐伐替尼治疗后的裸鼠肝癌移植瘤中，Cry2的表达下调。本研究中，Cry2在乐伐替尼耐药细胞株Huh-7/LR中的表达水平显著低于亲本细胞株Huh-7。当上调Huh-7/LR细胞中Cry2表达水平后，耐药株细胞对乐伐替尼的敏感性上升。因此，推测Cry2低表达可能参与HCC细胞乐伐替尼耐药形成过程。

m⁶A甲基化修饰是目前最普遍的RNA修饰形式之一，该过程由3种类型的调节因子执行：甲基转移酶、去甲基化酶和m⁶A结合蛋白。m⁶A甲基化修饰在HCC耐药过程中发挥重要作用^[7]。METTL3是甲基转移酶的核心蛋白之一，METTL3以m⁶A依赖的方式调节RNA的表达，参与HCC的发生、发展和耐药^[13-14]。本研究发现，乐伐替尼耐药细胞株Huh-7/LR中RNA m⁶A甲基化水平升高，METTL3蛋白表达上调，而其他m⁶A甲基转移酶METTL14、WTAP和VIRMA蛋白则无明显变化。提示METTL3介导的m⁶A甲基化修饰在Huh-7/LR细胞中异常活跃，但Huh-7/LR细胞中Cry2低表达是否与高水平的m⁶A甲基化修饰有关还需进一步明确。

m⁶A甲基化修饰是一个动态可逆的过程，参与调节mRNA的稳定性和降解。研究^[15]显示，降低Cry2甲基化水平导致Cry2表达增加，可以抑制食管鳞癌的生长和转移。消除Cry2启动子甲基化、增加Cry2表达有助于降低乳腺癌患者转移复发风险^[16]。本研究中，抑制METTL3表达可降低Huh-7/LR细胞中Cry2甲基化水平，从而导致Cry2表达水平升高；而当METTL3过表达时，Huh-7/LR细胞中Cry2甲基化水平升高，Cry2表达水平降低，这些结果提示Huh-7/LR细胞中Cry2低表达可能是由METTL3介导的m⁶A甲基化修饰所致。此外，本研究还发现，沉默METTL3可增强耐药株Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的敏感性，而沉默Cry2则可部分逆转METTL3基因沉默对Huh-7/LR细胞乐伐替尼的增敏作用。

综上所述，Cry2在Huh-7/LR细胞中表达下调，抑制METTL3介导的m⁶A甲基化修饰可增加Cry2的表达，从而提高细胞对乐伐替尼的敏感性。本研究初步揭示了HCC乐伐替尼耐药的部分机制，为逆转HCC乐伐替尼耐药提供了重要的方向。然而，本研究结果尚未揭示Cry2调控HCC细胞药敏性的具体途径。在后续研究中，课题组将以Cry2调控外排相关转运蛋白表达为方向，探讨Cry2参与HCC靶向药耐药形成的分子机制。