宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）是子宫内膜纤维化的表现，是女性最常见的生殖系统疾病之一，临床表现包括月经紊乱、不孕等^[1]。已有研究^[2]显示，子宫内膜上皮细胞（endometrial epithelial cells，EECs）能够由上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）拥有间充质细胞的特性，从而加剧纤维化。然而目前尚未明确IUA初始阶段与进展阶段的潜在分子特征。研究^[3]显示，多种疾病都存在长链非编码RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）异常表达现象，同时显著影响疾病的进展。已有研究^[4]针对IUA患者以及正常人的子宫内膜，借助转录组测序技术完成了RNA-Seq测序，获得实验组和对照组lncRNA差异表达谱，表明lncRNA ADIRF-AS1表达有显著差异。然而还未充分明确IUA与lncRNA ADIRF-AS1之间的联系。本研究探讨lncRNA ADIRF-AS1对人EECs增殖的影响及其对宫腔粘连的作用机制，旨在为明确IUA的发病机制提供参考和依据。

1 材料与方法 1.1 组织、细胞来源和主要试剂

收集2022年1月至2024年6月我院生殖医学科确诊的20例中重度IUA患者以及20例正常子宫内膜患者的子宫内膜组织和外周血。本研究获得北部战区总医院医学伦理委员会批准（202H2023KPJ018），所有研究对象签署知情同意书。

EECs、293T细胞均购自中国科学院上海细胞库。

lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；ADIRF-AS1过表达质粒（oe-ADIRF-AS1）、阴性对照质粒（oe-NC），miR-185-5p模拟物（mimics）、si-miR-185-5p、对应的阴性对照（mimics NC、inhibitor NC）及SIX同源盒蛋白4（Six homeobox 4， SIX4）过表达质粒（p-SIX4）、空载体质粒均由苏州吉玛基因股份有限公司合成；E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-CA）、角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）、成纤维细胞特异蛋白1（fibroblast specific protein 1，FSP-1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、ZEB1、SIX4及GAPDH一抗均购自英国abcam公司；HRP标记的二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol试剂、实时定量PCR试剂盒、反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司；双萤光素酶报告基因测定试剂盒购自上海和元生物科技有限公司；细胞凋亡试剂盒、CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL发光试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；4%多聚甲醛、0.5%结晶紫染液购自北京索莱宝科技有限公司；EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）染色试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、转染

EECs、293T细胞均采用含10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）与1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基（美国HyClone公司），置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，待细胞融合度达70%~80%时进行传代或转染。转染操作严格按照lipofectamine 3000试剂说明书进行。将细胞以5×10⁵/孔接种于6孔板，培养24 h后更换无血清无抗培养基；将脂质体与相应质粒/微RNA（microRNA，miRNA）按照1∶2混匀，室温孵育20 min后加入细胞孔中，继续培养6 h后更换为完全培养基，培养48 h后收集细胞进行后续实验。另取对数生长期的EECs用于构建纤维化细胞模型，待细胞贴壁融合度达50%~60%时，实验组加入终浓度10 ng/mL的转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1；美国Peprotech公司）无血清培养基，对照组加入等体积无血清培养基，37℃、5% CO₂培养24 h后收集细胞，用于后续检测。

1.2.2 实时定量PCR

利用TRIzol提取组织和细胞RNA，反转录成cDNA，使用实时定量PCR试剂盒进行检测。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35~40个循环。内参采用GAPDH与U6。引物序列如下：ADIRF-AS1，正向5’-GCCAGTGGTTGTTGGTGATT-3’，反向5’-CCAGCAGCAAGATGATGAGG-3’；miR-185-5p，正向5’-GCCGGTGAGTTCTCCAGGTG-3’，反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；SIX4，正向5’-GCATTGAACCCACCAAAAATGT-3’，反向5’-GGAAGTAGACCCCAGTATGTCA-3’；E-CA，正向5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3’，反向5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3’；CK-18，正向5’-GGAAGATGCTGAAGATGCTG-3’，反向5’-GCTGTTGTTGTTGCTGTTGG-3’；FSP-1，正向5’-ATGGCAGATGATGATGATGG-3’，反向5’-TCAGTTGTTGTTGCTGTTGG-3’；α-SMA，正向5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，反向5’-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3’；GAPDH，正向5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；U6，正向5’- CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。按照2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.3 生物信息学分析

采用starBase 3.0在线数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/）预测ADIRF-AS1与miR-185-5p靶向结合位点。

1.2.4 双萤光素酶报告基因实验

根据生物信息学预测的结合位点，构建ADIRF-AS1野生型萤光素酶报告载体（ADIRF-AS1-WT）、突变型报告载体（ADIRF-AS1-MUT），以及SIX4 3’UTR野生型报告载体（SIX4-WT）、突变型报告载体（SIX4-MUT），所有载体均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。将293T细胞以2×10⁴/孔接种于96孔板，培养24 h后，将报告载体与miR-185-5p mimics/mimics NC按照1∶1共转染至293T细胞，每组设3个复孔。转染48 h后，按照双萤光素酶报告基因测定试剂盒说明书操作，利用多功能酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）检测萤光素酶的活性。

1.2.5 CCK-8检测

将对数生长期的各组EECs以3×10³/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，置于培养箱中常规培养。分别在培养0、24、48、72 h时，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后采用多功能酶标仪检测450 nm波长处的吸光度（optical density，OD）。

1.2.6 EdU染色

将细胞接种于培养板，待其贴壁加入适量EdU继续培养，细胞固定与透化后加入反应液，染色、封片。荧光显微镜下查看并拍照，统计EdU阳性细胞。其中，红色荧光反应为EdU阳性细胞，蓝色荧光反应为DAPI阳性细胞。使用ImageJ软件计数EdU阳性细胞和DAPI阳性细胞，计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）= EdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞总数×100。

1.2.7 Transwell实验

在Transwell下室中加入含10%胎牛血清的培养基作为化学引诱剂，在上室中添加不含胎牛血清的细胞悬浮液并且基质胶包被上室。孵育24 h后从上室中取出未能迁移或侵入的细胞，迁移或侵入的细胞用4%多聚甲醛固定10 min后，使用0.5%结晶紫染色。在倒置显微镜下随机视野中计数细胞。

1.2.8 细胞划痕实验

将各组EECs以1×10⁶/mL的浓度接种6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液，培养至细胞融合率90%~100%。用无菌10 μL移液器枪头在细胞层上沿直尺划痕，用PBS漂洗3次，洗去划落的细胞，加入无血清培养基继续培养。分别在划痕后0、48 h时，在倒置显微镜（日本Olympus公司）下观察并拍照，采用ImageJ软件测量划痕宽度。划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度−48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100。

1.2.9 Western blotting

收集各组EECs，加入预冷的RIPA蛋白裂解液（含1%蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液。提取的蛋白采用BCA法定量分析，总蛋白使用10% SDS-PAGE电泳分离，随后将蛋白转印至PVDF膜（美国Millipore公司）。转膜完成后用5%脱脂牛奶封闭液在室温下封闭1~2 h；然后用TBST漂洗膜3次，每次10 min，加入一抗（E-CA 1∶1 000、CK-18 1∶1 000、FSP-1 1∶1 000、α-SMA 1∶2 000、ZEB1 1∶1 000、SIX4 1∶1 000、GAPDH 1∶10 000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，加入HRP标记的二抗（1∶10 000），室温孵育2 h。最后用ECL发光试剂盒显影并拍照，用ImageJ软件分析各蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算各蛋白的相对表达量，实验独立重复3次。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。采用Spearman相关进行相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 ADIRF-AS1在IUA患者子宫内膜组织、外周血以及TGF-β1处理的EECs中的表达水平及对EECs增殖、侵袭及迁移的影响

结果显示，与对照组比较，IUA患者子宫内膜组织及外周血中ADIRF-AS1表达明显升高（P < 0.05），见图 1A、1B。通过TGF-β1处理EECs，构建纤维化细胞模型，实时定量PCR检测ADIRF-AS1表达情况。结果发现，与未处理EECs相比，TGF-β1处理的EECs中ADIRF-AS1表达显著升高（P < 0.05），见图 1C。EECs转染oe-ADIRF-AS1及oe-NC质粒结果显示，ADIRF-AS1上调能够显著促进EECs增殖、侵袭及迁移能力（P < 0.05），见图 1D~1G。

2.2 ADIRF-AS1靶向调控miR-185-5p

已有研究^[3]发现，lncRNA对于miRNA具有吸附能力，并有效调控其表达。starBase在线数据库的预测结果表明，ADIRF-AS1可能与miR-185-5p结合，见图 2A。双萤光素酶报告基因检测结果显示，ADIRF-AS1与miR-185-5p结合，见图 2B。miR-185-5p检测结果表明，ADIRF-AS1过表达能够显著下调EECs中miR-185-5p的表达（P < 0.05），且二者的表达显著负相关（P < 0.01），见图 2 C、2D。

2.3 miR-185-5p在IUA患者子宫内膜组织、外周血以及TGF-β1处理的EECs中的表达及其对EECs增殖、侵袭及迁移的影响

结果显示，与对照组比较，miR-185-5p在IUA患者子宫内膜组织及外周血中表达明显降低（P < 0.05），见图 3A、3B。TGF-β1处理后EECs的miR-185-5p表达结果显示，与未处理EECs相比，TGF-β1处理的EECs中miR-185-5p表达显著减少（P < 0.05），见图 3C。si-miR-185-5p与si-NC质粒转染EECs，结果显示，miR-185-5p下调能够显著促进EECs增殖活力、侵袭及迁移能力，见图 3D~3G。

2.4 TGF-β1处理以及转染si-miR-185-5p的EECs中EMT相关基因的表达

实时定量PCR检测结果显示，与正常EECs相比，TGF-β1刺激后的EECs中上皮细胞标志物E-CA和CK-18 mRNA表达显著降低（P < 0.05）；间质细胞标志物FSP-1和α-SMA mRNA表达显著升高（P < 0.05）。转染si-miR-185-5p及si-NC质粒后EECs的EMT标志物的mRNA表达结果显示，与转染si-NC的EECs相比，转染si-miR-185-5p后EECs的E-CA和CK-18 mRNA表达降低（P < 0.05），FSP-1和α-SMA mRNA表达增加（P < 0.05），见图 4。

2.5 miR-185-5p靶向调控SIX4表达促进EMT

结果显示，与对照组比较，IUA患者子宫内膜组织及外周血中SIX4表达明显升高（P < 0.05），见图 5A、5B。与未处理的EECs相比，TGF-β1处理的EECs中SIX4表达显著增加（P < 0.05），见图 5C。

双萤光素酶报告基因检测证实miR-185-5p能够与SIX4结合，见图 5D。实时定量PCR检测SIX4的表达结果显示，与转染mimics NC组比较，转染miR-185-5p mimics组EECs的SIX4表达显著降低（P < 0.05）；与转染inhibitor NC组相比，转染si-miR-185-5p组EECs的SIX4表达显著上升（P < 0.05），见图 5E。表明miR-185-5p下调SIX4的表达。

Western blotting检测EMT相关蛋白（ZEB1、E-CA、CK-18、FSP-1和α-SMA）表达，结果显示，与转染空质粒组相比，转染p-SIX4组EECs的E-CA（1.00±0.05 vs. 0.32±0.04）和CK-18（1.00±0.06 vs. 0.28±0.03）蛋白表达下降（P < 0.05），ZEB1（1.00±0.04 vs. 1.85±0.12）、FSP-1（1.00±0.05 vs. 2.51±0.15）和α-SMA（1.00±0.03 vs. 2.56±0.18）蛋白表达升高（P < 0.05），见图 5F。证实过表达SIX4可诱导EECs发生EMT。

3 讨论

IUA危害育龄女性的生殖健康，尤其是中重度IUA是子宫性闭经和不孕最主要的病因^[5]。因此，明确IUA的发病机制具有重要的意义。

lncRNA的长度 > 200个核苷酸，其表达量较miRNA少，但具有较强的时空与组织特异性，且可在循环中保持稳定，具备良好的临床应用潜能^[6]。lncRNA可作为竞争性内源性RNA通过“海绵”吸附机制结合miRNA，进而调控基因表达 ^[7]。已有研究证实，lncRNA和一些重要器官的纤维化活动有关。一项针对子宫腺肌病的研究^[8]发现，EECs细胞核中lncRNA TUG1可结合转录因子E2F4，抑制下游基因转录，提升EECs增殖活性，并促进血管生成，诱导EECs侵袭与迁移，加剧EMT。WU等^[9]研究发现，lncRNA HOTAIR在IUA组织中，以及经TGF-β1/Smad通路激活促纤维化蛋白基因转录的EECs中表达水平均显著升高，lncRNA HOTAIR可诱导人EECs分化为肌纤维细胞，进而促进子宫内膜纤维化的发生发展。BROOKS等^[10]研究结果表明，lncRNA ADIRF-AS1通过PBAF作为调节的特定基因促进肾透明细胞癌进展。ZHONG等^[11]研究发现lncRNA ADIRF-AS1结合miR-214-3p可以通过靶向SERPINA1来减轻椎间盘退变。本研究结果显示，lncRNA ADIRF-AS1在IUA子宫内膜组织、外周血以及经TGF-β1处理的EECs中表达水平显著升高。推测IUA的形成与发展可能与ADIRF-AS1上调有关。实验验证EECs的EMT响应与原代细胞一致，研究结果表明，ADIRF-AS1升高促进了EECs增殖活力、侵袭及迁移能力。

miRNA可在转录后水平调控靶基因表达，与多种疾病的发生和发展密切相关^[12]，而且lncRNA可通过结合miRNA的种子序列抑制其活性^[13-14]。starBase数据库预测结果显示，miR-185-5p可能是ADIRF-AS1的靶基因；萤光素酶报告基因实验结果显示，ADIRF-AS1与miR-185-5p存在结合的靶向序列。LIU等^[15]发现，miR-543能够下调纤维化相关基因的表达，而高表达miR-543可能与α-SMA表达下调有关，由此调控子宫内膜纤维化活动，并影响胶原蛋白含量；miR-543还能抑制N-钙黏蛋白的表达，通过外泌体从人脐带间充质干细胞转移到受损的EECs中，从而缓解子宫内膜的纤维化^[16]。李奇炯等^[17]证实通过调节YWHAZ，miR-185-5p可抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭、增殖，促进细胞凋亡。EECs发生EMT，会丢失E-CA等上皮特征并获得间质细胞特性，进而增强迁移侵袭能力。本研究结果表明，IUA患者子宫内膜组织、外周血以及TGF-β1处理的EECs中miR-185-5p的表达明显降低，而miR-185-5p低表达可以促进EECs增殖、侵袭及迁移能力。

子宫内膜纤维化的特征表现为宫腔、子宫颈纤维粘连，纤维组织区域未分布活性子宫内膜组织，是子宫内膜纤维化的基本病理特征，但目前尚未完全阐明其确切的发病机制^[18]。EMT是EECs失去原有上皮特征、获得间质细胞特性的生物学过程，其典型特征为上皮标志物表达减少、间质标志物表达增加^[2]。本研究发现TGF-β1诱导的EECs中出现了EMT，这进一步证实了EMT在IUA发生发展中发挥了重要的作用。SIX4是同源盒基因SIX家族中的一员，它的异常高表达能促进细胞的异常增殖，促进新血管的形成，加速浸润以及迁移，由此显著影响诸多疾病的形成与进展^[19]。SIX4在IUA发生与发展中的作用尚未明确。在子宫内膜样腺癌组织中SIX4呈高表达，靶向抑制SIX4可通过EMT通路降低癌细胞侵袭与迁移能力，提示SIX4可促进肿瘤侵袭转移，进而加速疾病进展^[20]。研究^[21]发现SIX4对肺癌等细胞EMT、迁移与侵袭具有促进作用。研究^[22]显示，SIX4表达下调后，E-CA表达上调，Vimentin与N-钙黏蛋白表达下调，使肝癌细胞侵袭与增殖活性减弱，可能会对肝癌产生抑制效果。本研究双萤光素酶报告基因实验证实SIX4是miR-185-5p的靶基因。本研究发现SIX4在IUA患者体内及TGF-β1处理的EECs中高表达。过表达SIX4可显著诱导EECs发生EMT，证实SIX4是介导EECs EMT的关键分子，其在IUA中的促纤维化作用与在肝癌、肺癌中的调控作用一致。

综上所述，lncRNA ADIRF-AS1在IUA患者子宫内膜组织、外周血以及TGF-β1处理的EECs中表达显著上调，ADIRF-AS1通过miR-185-5p/SIX4轴促进EMT，从而促进宫腔粘连的发生。ADIRF-AS1调控miR-185-5p/SIX4轴可能成为治疗IUA的新靶点。IUA的病理还涉及炎症、缺氧等多种因素的协同作用，本研究仅采用TGF-β1处理细胞是为了明确TGF-β1的核心因果关系，TGF-β1在真实微环境中的效应可能受到其他因子（如IL-6、HIF-1α）的调节。因此，未来需要构建包含炎症和缺氧等因素的复合模型，深入探讨TGF-β1信号通路与其他关键通路之间的交叉对话，从而更全面地阐明IUA的发病机制，为开发多靶点治疗策略提供依据。