关节软骨因缺乏血管和神经，自我修复能力极差^[1]。机械损伤或退行性变导致的软骨缺损，若不及时干预，将不可逆地进展为骨关节炎^[2-3]，导致关节畸形和功能障碍^[4-5]。临床现有的微骨折、自体软骨移植等疗法虽能缓解症状，但难以再生天然透明软骨，且易形成纤维软骨，长期疗效受限^[6]。间充质干细胞因具有多向分化潜能，成为软骨组织工程的研究重点。相较于无法模拟三维微环境的传统二维培养，类器官技术通过体外自组装，能高度还原体内细胞与基质间的相互作用。其中，脱细胞细胞外基质（decellularized extracellular matrix，dECM）因富含生物活性成分且能诱导干细胞向软骨分化，是构建软骨类器官（cartilage organoid，CORG）的理想支架^[7]。本课题组前期研究^[8]利用150~300 μm的dECM微载体成功构建了CORG，但仍存在细胞分布不均、组织致密度不足等问题。由于材料的颗粒大小、孔隙率等物理特性会显著影响细胞行为，本课题组推测更小尺寸的dECM微载体能通过增加与种子细胞的接触面积，促进更紧密的结合和基质分泌。因此，本研究将大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell，BMSC）复合不同尺寸的dECM微载体，对比尺寸效应，以探索更优化的CORG构建策略。

1 材料与方法 1.1 材料

大鼠BMSC，购自美国Cyagen公司；大鼠BMSC成软骨诱导培养基、阿利辛蓝染色液、番红O染色液，购自原启生物科技（上海）有限责任公司；超低黏附96孔U型板，购自美国Corning公司；苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色液、CCK-8试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；兔来源SOX9一抗，购自美国abcam公司；Calcein-AM/PI细胞活性和细胞毒性检测试剂盒，购自北京碧云天科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA提取试剂盒，购自德国Qiagen公司；体视显微镜，购自日本Nikon公司；实时荧光定量PCR仪，购自美国ThermoFisher Scientific公司；全景共聚焦数字切片扫描仪，购自上海达迈生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 dECM微载体制备

从市场购买新鲜猪膝关节，无菌采集其透明软骨，切成3 mm×3 mm×1 mm小块，通过-80 ℃/4 ℃冻融循环和1%十二烷基硫酸钠振荡72 h进行脱细胞处理，随后用PBS清洗72 h以去除残留。将脱细胞软骨片用组织研磨仪粉碎并过筛，收集粒径分别为150~300 μm和50~80 μm的dECM微载体，经⁶⁰Co辐照灭菌后，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 脱细胞前后的DNA定量、细胞外基质成分分析和微载体粒径分析

分别取脱细胞前后的软骨片20 mg，分为天然软骨组（Natural组）和脱细胞组（Decellularization组），经液氮研磨和蛋白酶K消化后，采用DNA提取试剂盒提取总DNA。采用酶标仪测定520 nm处的吸光度，计算浓度，以评价脱细胞效率。制备10 μm冰冻切片，采用DAPI染色观察细胞核残留情况；采用HE染色观察组织形态；采用甲苯胺蓝和番红O染色评价细胞外基质中蛋白多糖等成分的保留情况。采用300、150、80和50 μm规格的筛网过筛，制备大尺寸微载体（150~300 μm）和小尺寸微载体（50~80 μm）。将微载体悬浮于PBS中，制备玻片。光学显微镜下随机选取10个视野，使用ImageJ软件测量至少100个颗粒的等效直径，计算颗粒的平均直径、分布范围和标准偏差。

1.2.3 dECM微载体的细胞毒性和生物相容性检测

将⁶⁰Co灭菌后的微载体按0.2 g/mL质量浓度浸泡于MEM-α完全培养基中，37 ℃提取24 h，收集浸提液。将P3代大鼠BMSC以8×10³/孔的密度接种于96孔板，贴壁24 h后，浸提液组（Extract组）更换为微载体浸提液，对照组（Control组）使用常规培养基。分别于培养第1、3、5天加入CCK-8试剂，孵育1 h后，应用酶标仪检测450 nm处的吸光度值，评价微载体的细胞毒性及其对细胞增殖的影响。应用Calcein-AM/PI试剂盒评估微载体对细胞活性的影响，将P3代大鼠BMSC以2×10⁴/孔的密度接种于含爬片的24孔板，贴壁后更换为浸提液。分别于第1、3、5天，按1∶1∶1 000比例配制Calcein-AM/PI工作液，室温避光孵育20 min。荧光显微镜下观察并拍摄活细胞（绿色）和死细胞（红色）的分布情况，以评价其生物相容性。

1.2.4 2种尺寸的dECM微载体构建CORG

分别用小尺寸dECM微载体（SCORG组）和大尺寸dECM微载体（HCORG组）构建CORG。将大鼠BMSC原代细胞传代至P3代，进行细胞实验。将P3代大鼠BMSC（5×10⁵/孔）按10 mg微载体/孔的比例，接种于低黏附U型96孔板（200 μL/孔）。首先使用MEM-α完全培养基预培养3 d，促使细胞与微载体自组装成CORG，随后更换为OriCell成软骨诱导培养基诱导21 d。诱导期间，每2 d更换一半（100 μL）培养液，并分别于第0、7、14和21天取材检测。

1.2.5 软骨形成基因和细胞黏附相关基因检测

分别收集第0、7、14和21天SCORG组和HCORG组的CORG样品，按说明书提取总RNA，反转录为cDNA。采用实时定量PCR检测成软骨基因（SOX9、COLⅡ、ACAN）和细胞黏附基因（ITGB1、ITGA5）的表达水平。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

引物序列：SOX9，正向5’-GCGGAGGAAGTCGGTGAAGAT-3’，反向5’- GTAGACGGGTTGTTCCCAGT-3’；ACAN，正向5’-CTAGTGGACTCCCTTCAGGAAC-3’，反向5’-CGCTAAGCTCAGTCACTCCAG-3’；COLⅡ，正向5’-CCAGATGACCTTCCTACGCC-3’，反向5’-TTCAGGGCAGTGTACGTGAAC-3’；ITGB1，正向5’-CAGCCGCTTCACCTACAGC-3’，反向5’-TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC-3’；ITGA5，正向5’-CTCACAGCTGGCAGGGTATC-3’，反向5’-TTAGAGACTGCATGTTAGTTCTGGA-3’；GAPDH，正向5’-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向5’-ATGAGCCCTTCCACAATG-3’。

1.2.6 2种尺寸微载体构建的CORG的大体观和促细胞增殖能力检测

收集SCORG组和HCORG组中诱导14 d的CORG，PBS清洗后，体视显微镜下观察其大体观。第14天时，将2组CORG按1.2.2的方法提取DNA，应用酶标仪检测520 nm处的吸光度值，通过标准曲线计算DNA含量，以评价CORG内细胞增殖水平。

1.2.7 2种尺寸微载体构建的CORG的组织化学染色

收集SCORG组和HCORG组中诱导14 d的CORG，经4%多聚甲醛固定24 h和30%蔗糖脱水后，用OCT包埋，制备10 μm冰冻切片。进行HE、阿利辛蓝染色和番红O染色，以评价酸性蛋白聚糖的分泌。切片经梯度脱水、透明和封片处理后，显微镜下观察CORG的组织形态和基质分布。

1.2.8 2种尺寸微载体构建的CORG的免疫荧光染色

收集SCORG组和HCORG组中诱导14 d的CORG，经4%多聚甲醛固定24 h和30%蔗糖脱水后，用OCT包埋，制备10 μm冰冻切片。切片经0.5% Triton X-100通透和抗原修复后，用5%牛血清白蛋白封闭1 h。随后滴加SOX9一抗（1∶200），4 ℃孵育16 h。次日滴加荧光二抗，避光孵育2 h，用DAPI复染细胞核。经抗荧光淬灭封片后，荧光显微镜下观察目的蛋白的表达和分布。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析和图表绘制。所有实验均独立重复至少3次，取均值进行统计分析。所有数据通过正态性检验，计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 软骨片脱细胞效果验证和尺寸筛选

脱细胞前，Natural组中可见大量蓝色荧光标记的细胞核结构；脱细胞处理后，Decellularization组软骨基质中未见明显细胞核残留，表明细胞成分已被完全清除（图 1A）。DNA定量检测结果显示，Natural组和Decellularization组DNA含量分别为（22.584±0.819）和（1.606±0.178）ng/mL，Decellularization组软骨片中DNA含量显著降低（P < 0.001）。HE、甲苯胺蓝和番红O染色结果（图 1B~1D）进一步表明，Decellularization组软骨片细胞外基质成分保留完整，细胞核被彻底去除。粒径分选的结果（图 1E）显示，大尺寸和小尺寸微载体的平均直径分别为（217.70±57.23）μm和（68.46±10.73）μm，成功筛选出具有显著尺寸梯度的2组dECM微载体。

2.2 dECM微载体的细胞毒性和生物相容性实验

CCK-8结果（图 2A）显示，Extract组第1、3、5天时的细胞活性呈持续上升趋势，证实微载体无明显细胞毒性。活/死细胞染色结果（图 2B）显示，与浸提液共培养的大鼠BMSC铺展良好，在第1、3、5天均观察到大量活细胞（绿色），死细胞极少（红色），细胞密度随时间推移显著增加，进一步验证了微载体优异的生物相容性。

2.3 2组CORG的基因表达情况

SCORG组和HCORG组中CORG在7、14、21d这3个时间点均表现出软骨相关基因高表达，SOX9、COLⅡ、ACAN在14 d时表达量最高（P < 0.001），且SCORG组高于HCORG组（P < 0.01）。与此类似，SCORG组中细胞黏附相关基因ITGB1、ITGA5的表达量也显著高于HCORG组（P < 0.01），于14 d时达到峰值，成功筛选出14 d为CORG最佳诱导时间点。见图 3。

2.4 2组CORG肉眼观察、促增殖能力和组织化学染色

肉眼观察显示（图 4A），SCORG组中CORG表面圆润平滑，形态规则；而HCORG组中CORG形状不规则，边缘凸起。DNA定量结果（图 4B）证实，培养14 d后SCORG组的DNA含量显著高于HCORG组，表明小尺寸dECM微载体具有更强的促细胞增殖能力（P < 0.01）。荧光强度定量分析结果（图 4C）显示，SCORG组SOX9 mRNA平均表达水平显著高于HCORG组（P < 0.01），表明小尺寸dECM微载体能更有效地诱导BMSC向成软骨方向分化。HE染色结果（图 4D）显示，SCORG组边界清晰、圆度高，细胞在微载体间分布均匀有序，形成了紧密的细胞-基质整合结构；HCORG组细胞分布不均，呈聚集现象，内部可见明显中空。阿利辛蓝和番红O染色结果（图 4D）进一步证实，SCORG组在整个球体范围内均有丰富的蛋白多糖和黏多糖分泌，构成了良好的生理性仿生网络；而HCORG组基质分泌量较少，且缺乏空间联系。免疫荧光染色结果（图 4E）显示，成软骨关键因子SOX9在SCORG组中呈全球体广泛阳性表达，且与微载体高度整合；HCORG组中SOX9信号主要局限于球体表面。

3 讨论

本研究通过制备生物活性优异的dECM微载体，通过粒径分析筛选出大、小2种尺寸的dECM微载体，复合BMSC，分别构建出HCORG组和SCORG组2种CORG。通过对比发现，SCORG组中CORG显著促进细胞增殖，具有更佳的软骨基质分泌能力和细胞间黏附能力，为CORG的构建方式提供了新思路。

关节软骨的自我修复能力有限。微骨折、软骨移植和软骨细胞移植等传统疗法虽能短期缓解症状，但往往因修复产物为纤维软骨（非透明软骨）而导致远期疗效不佳^[9]，且面临免疫排斥、手术成本高等问题^[10]。CORG能模拟三维仿生微环境，是理想的修复移植物。针对单纯细胞组装易出现的内部空心化的问题，引入生物活性材料提供支撑至关重要^[11]。与存在降解周期长、细胞亲和性不足等问题的合成材料比较，dECM具备天然的生物降解性、相容性和低免疫原性，是构建CORG的理想支架。

本研究利用物理化学法成功制备猪软骨dECM微载体。DNA定量和DAPI染色证实脱细胞彻底，组织化学染色显示基质成分保留良好。CCK-8和活/死细胞染色实验进一步验证了其无毒性且能显著促进细胞增殖。鉴于dECM来源广泛、成本低且已具备临床应用基础，基于dECM构建的CORG展现出显著的临床转化潜力^[12]。基于制备工艺的可行性，本研究将规格为（68.46±10.73）μm的dECM定义为小尺寸dECM微载体，将规格为（217.70±57.23）μm的dECM定义为大尺寸dECM微载体。

ECM的分泌水平直接决定软骨的抗压和支撑性能。实时定量PCR结果显示，SOX9、COLⅡ和ACAN等成软骨特异性基因在诱导14 d时达到峰值，随后下降，故确定14 d为CORG的最佳培养周期。组织学也进一步证实了CORG中细胞周围大量分泌软骨细胞外基质，这都与之前的研究^[13]结果一致。用2种尺寸的微载体构建CORG后，经实验证实，与HCORG组相比，SCORG组展现出更强的生物学性能。DNA定量结果显示，SCORG组细胞密度明显更高，成软骨特异性蛋白（SOX9）和基质成分（蛋白多糖、胶原）分泌更丰富，形态更趋于规则、圆润。这表明缩小微载体尺寸能显著提升dECM对BMSC向软骨分化的诱导效率。

天然软骨的力学强度依赖于细胞与基质间紧密的黏附网络。本研究中，SCORG组中黏附相关基因ITGB1和ITGA5的表达显著上调，表明小尺寸dECM微载体通过增加接触面积，增强了细胞-细胞和细胞-微载体间的通信。这种紧密的连接不仅对抗了收缩张力，还促进了机械信号转导，形成了类似天然软骨的致密三维结构。因此推测，SCORG组可能通过激活上游转录因子（如TWIST、SP1）^[14-15]，进而通过整合素α5β1介导FAK-Src或Rho GTPases等通路实现骨架重排和分化增强，其深层机制仍需进一步探究。

尽管已经成功构建了基于小尺寸dECM微载体的新型CORG（SCORG组），但仍需进一步开展体内移植实验，以评估其在原位软骨缺损中的修复效能。此外，微载体与细胞间相互作用的深层分子机制仍有待挖掘。

综上所述，本研究表明，与HCORG组相比，SCORG组在促进成软骨分化方面效能更优。SCORG组构建的疏松多孔网络和致密三维环境，在优化营养交换的同时，高度还原了天然软骨的力学和空间特性。小尺寸dECM微载体为CORG的构建提供了更优化的策略，不仅有望推动软骨再生技术的临床转化，也为高仿生体外药物筛选平台的建立奠定了基础。