2026, Vol. 55文章信息
- 郭仁艺, 符英杰, 林丁, 王运成
- GUO Renyi, FU Yingjie, LIN Ding, WANG Yuncheng
- 经颅直流电刺激通过抑制MCP-1/CCR2信号通路减轻膝骨关节炎大鼠疼痛症状
- Transcranial direct current stimulation alleviates pain in rats with knee osteoarthritis by inhibiting MCP-1/CCR2 signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2026, 55(4): 323-328
- Journal of China Medical University, 2026, 55(4): 323-328
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文章历史
- 收稿日期：2025-05-09
- 网络出版时间：2026-04-15 11:40:30
引用本文 |
骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，常见于中老年人，好发于膝关节、髋关节、脊柱、踝关节等处。在不同类型的骨关节炎中，膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）尤为常见。我国流行病学调查[1]结果显示，KOA的患病率为8.1%，且在65岁以上人群中患病率高达50%。KOA患者的疼痛属于炎症性疼痛。有研究[2]在KOA患者的关节内发现了许多类型的趋化因子，这些趋化因子能够促进炎症细胞的浸润和促炎性细胞因子的释放，从而引起关节炎症和疼痛反应。单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）是在KOA患者软骨、滑膜和滑膜液中高表达的趋化因子。趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）蛋白是位于免疫细胞表面的膜蛋白，为趋化因子受体，可以与MCP-1结合，介导机体的免疫反应。研究[3]证实，MCP-1/CCR2信号通路能够通过激活小胶质细胞等免疫细胞，加剧KOA的炎症性疼痛。治疗KOA的药物包括肾上腺素和双氯芬酸钠，这些药物短期效果良好，但没有镇痛效果[4]。经颅直流电刺激（trans-cranial direct current stimulation，tDCS）是通过采用不间断、低强度的直流电作用于大脑，影响大脑中神经元兴奋性的新型治疗技术[5]。临床研究[6]发现，tDCS能够通过抑制炎症反应，缓解KOA患者的疼痛症状。然而，tDCS缓解KOA疼痛的作用机制尚不清楚。因此，本研究通过构建KOA慢性疼痛大鼠模型，探究tDCS对KOA大鼠的镇痛效果，并基于MCP-1/CCR2信号通路初步探讨其可能的分子机制。
1 材料与方法 1.1 药物和试剂碘乙酸钠，购自上海麦克林生化科技股份有限公司；MCP-1，购自美国California-Bioscience公司；神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、离子钙结合衔接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β一抗，购自美国Cell Signaling Technology公司；原肌球蛋白受体激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TrkA）、生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）一抗，购自美国abcam公司。
1.2 实验动物和分组40只8~9周龄SPF级SD雄性大鼠，体重280~320 g，购自广东至远生物医药科技有限公司，生产许可证号SCXK（粤）2021-0057，适应性饲养7 d后进行实验。取10只大鼠作为假手术组，在左膝膝下韧带处向关节腔内注射60 μL生理盐水。另取30只大鼠，采用碘乙酸钠关节腔注射法构建KOA慢性疼痛大鼠模型[7]，在左膝膝下韧带处向关节腔内注射60 μL碘乙酸钠（80 g/L）。3周后，将30只KOA慢性疼痛大鼠随机分为模型组、tDCS组、tDCS+MCP-1组，每组10只。tDCS组、tDCS+MCP-1组大鼠先进行1周的固定适应性训练，采用自制固定笼，能够限制大鼠活动但不压迫其肢体，之后用固定器固定，采用tDCS仪进行治疗，20 min/d，连续治疗3周[8]。同时，tDCS+MCP-1组大鼠左膝关节腔内注射6 μL MCP-1（12.5 ng/mL），1次/周，连续注射3周[8]。本研究经海南医科大学伦理委员会审核批准（HYPLL-2025-002）。
1.3 热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency，TWL）和机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的测定于造模后和治疗结束后测定TWL和MWT。采用热辐射测痛仪测定各组大鼠的TWL，将大鼠放置于测试仪中适应20 min，随后设置辐射热为50 ℃，辐射热源照射大鼠的后足底表面并开始计时，后足收缩停止计时，记录反应时间（s）。实验重复3次，取平均值。采用von Frey细丝测定大鼠的MWT，将大鼠放置于测试装置内适应20 min，依照up-down法，将一系列von Frey细丝从2.0 g力度开始垂直刺激大鼠后足足底中部皮肤，使纤维弯曲5 s，大鼠出现短暂快速的肢体退缩为阳性反应，实验重复3次，取平均值。
1.4 标本采集大鼠行为学实验结束后，禁食12 h，用3%戊巴比妥钠麻醉，取膝关节组织和背根神经节。每组取4只大鼠的膝关节组织和背根神经节，用4%多聚甲醛固定，用于病理组织学检测；每组取剩余6只大鼠的膝关节组织和背根神经节，用于Western blotting。
1.5 免疫组织化学取固定的膝关节组织，脱钙、石蜡包埋并切片，切片抗原修复、NGF一抗孵育4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，细胞核复染，封片后，显微镜下观察并拍照。取固定的背根神经节，石蜡包埋、切片，Iba1一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h。其余操作同上。
1.6 Western blotting提取膝关节组织和背根神经节总蛋白，蛋白样品加等体积的变性液，煮沸10 min，随后进行Western blotting [4]。
1.7 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 tDCS对KOA大鼠疼痛行为学指标的影响与假手术组比较，造模后、治疗结束后模型组大鼠的TWL、MWT降低（P < 0.05）；与模型组比较，治疗结束后tDCS组大鼠的TWL、MWT升高（P < 0.05）；与tDCS组比较，治疗结束后tDCS+MCP-1组大鼠的TWL、MWT降低（P < 0.05）。见表 1。
| Item | Sham group（n = 10） | Model group（n = 10） | tDCS group（n = 10） | tDCS+MCP-1 group（n = 10） | F | P |
| TWL（s） | ||||||
| After modeling | 24.38±2.56 | 6.27±1.561） | 6.34±1.15 | 6.23±1.28 | 274.201 | < 0.001 |
| After treatment | 24.09±2.38 | 6.10±1.231） | 20.75±2.192），4） | 9.41±1.573），4） | 208.813 | < 0.001 |
| MWT（g） | ||||||
| After modeling | 15.58±2.86 | 3.73±1.051） | 3.68±1.28 | 3.67±1.53 | 106.547 | < 0.001 |
| After treatment | 15.43±2.65 | 3.24±1.171） | 12.85±2.342），4） | 8.45±1.313），4） | 73.334 | < 0.001 |
| 1）P < 0.05 vs. sham group at the same time point；2）P < 0.05 vs. model group at the same time point；3）P < 0.05 vs. tDCS group at the same time point；4）P < 0.05 vs. after modeling within group. | ||||||
2.2 tDCS对KOA大鼠膝关节组织中疼痛介质NGF蛋白表达的影响
免疫组织化学结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠膝关节组织中NGF蛋白表达增加；与模型组比较，tDCS组大鼠膝关节组织中NGF蛋白表达减少；与tDCS组比较，tDCS+MCP-1组大鼠膝关节组织中NGF蛋白表达增加。见图 1。
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| A, sham group; B, model group; C, tDCS group; D, tDCS+MCP-1 group. 图 1 免疫组织化学检测各组大鼠膝关节组织中NGF蛋白的表达和定位×400 Fig.1 Expression and localization of NGF protein in rat knee joint tissue in each group detected by immunohistochemistry ×400 |
2.3 tDCS对KOA大鼠膝关节组织中促炎性细胞因子表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠膝关节组织中IL-6、IL-1β蛋白表达增加（P < 0.05）；与模型组比较，tDCS组大鼠膝关节组织中IL-6、IL-1β蛋白表达减少（P < 0.05）；与tDCS组比较，tDCS+MCP-1组大鼠膝关节组织中IL-6、IL-1β蛋白表达增加（P < 0.05）。见图 2、表 2。
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| 1, sham group; 2, model group; 3, tDCS group; 4, tDCS+MCP-1 group. 图 2 Western blotting检测各组大鼠膝关节组织中促炎性细胞因子的表达 Fig.2 Expression of pro-inflammatory cytokines in rat knee joint tissue in each group detected by Western blotting |
| Item | Sham group（n = 10） | Model group（n = 10） | tDCS group（n = 10） | tDCS+MCP-1 group（n = 10） | F | P |
| IL-6/GAPDH | 0.31±0.03 | 0.97±0.081） | 0.38±0.022） | 0.82±0.083） | 89.702 | < 0.001 |
| IL-1β/GAPDH | 0.26±0.03 | 0.89±0.091） | 0.37±0.042） | 0.74±0.073） | 68.981 | < 0.001 |
| TrkA/GAPDH | 0.14±0.01 | 0.95±0.091） | 0.26±0.032） | 0.73±0.063） | 138.898 | < 0.001 |
| GAP43/GAPDH | 0.13±0.01 | 1.06±0.091） | 0.24±0.032） | 0.82±0.083） | 156.097 | < 0.001 |
| CGRP/GAPDH | 0.17±0.02 | 0.93±0.091） | 0.29±0.032） | 0.77±0.073） | 113.119 | < 0.001 |
| MCP-1/GAPDH | ||||||
| Knee joint | 0.17±0.02 | 0.82±0.081） | 0.18±0.022） | 0.62±0.053） | 130.753 | < 0.001 |
| Dorsal root ganglia | 0.13±0.01 | 0.59±0.061） | 0.11±0.012） | 0.43±0.043） | 122.296 | < 0.001 |
| CCR2/GAPDH | ||||||
| Knee joint | 0.26±0.03 | 0.88±0.081） | 0.24±0.032） | 0.57±0.053） | 102.383 | < 0.001 |
| Dorsal root ganglia | 0.27±0.03 | 0.91±0.081） | 0.35±0.032） | 0.75±0.073） | 87.450 | < 0.001 |
| 1）P < 0.05 vs. sham group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. tDCS group. | ||||||
2.4 tDCS对KOA大鼠背根神经节中疼痛相关蛋白表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠背根神经节中TrkA、GAP43、CGRP蛋白表达增加（P < 0.05）；与模型组比较，tDCS组大鼠背根神经节中TrkA、GAP43、CGRP蛋白表达减少（P < 0.05）；与tDCS组比较，tDCS+MCP-1组大鼠背根神经节中TrkA、GAP43、CGRP蛋白表达增加（P < 0.05）。见表 2、图 3。
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| 1, sham group; 2, model group; 3, tDCS group; 4, tDCS+MCP-1 group. 图 3 Western blotting检测各组大鼠背根神经节中TrkA、GAP43、CGRP蛋白的表达 Fig.3 Expression of TrkA, GAP43, and CGRP proteins in rat dorsal root ganglia in each group detected by Western blotting |
2.5 tDCS对KOA大鼠背根神经节中小胶质细胞活化的影响
免疫组织化学结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠背根神经节中Iba1蛋白表达增加；与模型组比较，tDCS组大鼠背根神经节中Iba1蛋白表达减少；与tDCS组比较，tDCS+MCP-1组大鼠背根神经节中Iba1蛋白表达增加。见图 4。
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| A, sham group; B, model group; C, tDCS group; D, tDCS+MCP-1 group. 图 4 免疫组织化学检测各组大鼠背根神经节中Iba1蛋白的表达×400 Fig.4 Expression of Iba1 protein in rat dorsal root ganglia in each group detected by immunohistochemistry ×400 |
2.6 tDCS对KOA大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1/CCR2信号通路的影响
与假手术组比较，模型组大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1、CCR2蛋白表达增加（P < 0.05）；与模型组比较，tDCS组大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1、CCR2蛋白表达减少（P < 0.05）；与tDCS组比较，tDCS+MCP-1组大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1、CCR2蛋白表达增加（P < 0.05）。见图 5、表 2。
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| A, knee tissue; B, dorsal root ganglia. 1, sham group; 2, model group; 3, tDCS group; 4, tDCS+MCP-1 group. 图 5 Western blotting检测各组大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1、CCR2蛋白的表达 Fig.5 Expression of MCP-1 and CCR2 proteins in rat knee joint tissue and dorsal root ganglia in each group detected by Western blotting |
3 讨论
KOA是一种常见的退行性骨和关节疾病，其特点是临床发病率高、持续时间长、疼痛和活动受限，主要影响中老年人群[1]。炎症性疼痛是KOA患者重要的临床症状之一。随着疾病的进展，持续的炎症刺激和神经元损伤可能导致中枢痛觉敏化[9]。tDCS是使用电流刺激大脑，从而影响大脑神经元兴奋性的一种新型疗法。
目前的临床研究[6]发现，tDCS能有效缓解KOA患者的疼痛症状。基础研究[10]结果也表明，tDCS能够显著缓解KOA大鼠的慢性疼痛。本研究发现，tDCS能改善KOA大鼠TWL、MWT等疼痛行为学指标，表明tDCS能减轻KOA大鼠疼痛症状。然而，在疼痛行为学指标的检测过程中，一部分实验结果的变异度特别大，可能是由于测得的数值本身比较小，但是各大鼠的TWL、MWT数值确实会出现1~3 s或1~3 g的差异，因此部分实验结果的变异度会比较大。
KOA相关疼痛不仅与局部关节结构损伤有关，还与支配关节的外周感觉神经损伤和中枢神经回路改变有关。既往研究[11]证实，KOA关节损伤后，炎性因子的释放不仅会引起膝关节局部的炎症性疼痛，还会损伤背根神经节等中枢神经。外周神经末梢的NGF-TrkA复合体将细胞信号传递给背根神经节，导致CGRP和GAP43等疼痛相关蛋白的表达上调，这个过程使周围神经系统敏感，并促进疼痛神经纤维长入[12]。因此，阻断NGF-TrkA或其下游信号可能有利于抑制KOA疼痛反应。本研究发现，tDCS能抑制KOA大鼠膝关节组织中NGF和背根神经节中TrkA、GAP43、CGRP的表达，表明tDCS可能通过抑制NGF/TrkA信号通路来抑制痛觉信号传输，进而减轻KOA大鼠的疼痛症状。各种炎性细胞因子会引起KOA疼痛，其中IL类炎性细胞因子最为突出，抑制IL-1β、IL-6能够减轻炎症介质引起的KOA疼痛[13]。背根神经节小胶质细胞激活在慢性神经性疼痛的发生和维持中起重要作用。小胶质细胞被激活后，促炎性细胞因子（如IL-6、IL-1β）的分泌增加，导致神经炎症加重。研究[14]发现，抑制脊髓背角中小胶质细胞的激活能显著缓解KOA大鼠的神经疼痛。本研究发现，tDCS能够抑制KOA大鼠膝关节组织中IL-6、IL-1β和背根神经节中小胶质细胞激活标志物Iba1的表达，表明tDCS可能通过抑制膝关节和背根神经节炎症来减轻KOA大鼠的疼痛症状。
MCP-1/CCR2信号通路是一条重要的单核细胞趋化信号通路。软骨损伤可激活巨噬细胞，并增加KOA患者膝关节组织中趋化因子MCP-1的表达。MCP-1与免疫细胞表面的CCR2膜蛋白结合，促进KOA的炎症反应[3]。研究[15]证实，抑制MCP-1/CCR2信号通路有助于减轻OA大鼠的疼痛症状。本研究发现，tDCS能抑制KOA大鼠膝关节组织和背根神经节中MCP-1、CCR2蛋白的表达，且MCP-1能抑制tDCS对KOA大鼠疼痛、炎症相关指标的影响，表明tDCS可能通过抑制MCP-1/CCR2信号通路减轻KOA大鼠的炎症性疼痛反应。
本研究仅在造模后和治疗结束后检测大鼠的疼痛学行为，这是本研究的不足之处。后续研究应在造模后以及治疗1周、治疗2周、治疗3周后动态检测大鼠的疼痛学行为，以充分揭示tDCS对KOA大鼠疼痛症状的影响。
综上所述，本研究发现tDCS能够抑制促炎性细胞因子分泌和疼痛相关蛋白表达，减轻KOA大鼠的疼痛症状，其机制可能与抑制MCP-1/CCR2信号通路激活有关。
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