食管癌是全球范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病有明显的地域差异^[1]。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我国最常见的食管癌类型，其生长迅速、淋巴转移率高，患者早期通常无明显的特异性症状，中晚期才被发现，5年生存率低^[2]。因此，探究ESCC发展的病理机制仍是ESCC防治和早期诊断中亟待解决的问题。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微RNA（microRNA，miRNA）已被证明在ESCC的发生、早期诊断和治疗中起重要作用^[3-4]。LINC01082对ESCC具有非侵入性诊断潜力，其诊断准确性优于或与当前的临床血清学标志物相当^[5]。研究^[6-7]发现，ESCC早期患者血浆中miR-18a表达水平显著高于健康对照者，提示miR-18a可用于ESCC的早期筛查，并可能成为潜在的新型生物标志物。CADM2是位于细胞表面的蛋白质，是一种肿瘤抑制因子^[8]。研究^[9]发现，与邻近的正常组织相比，ESCC组织中CADM2表达显著下调。本研究前期通过生物信息学方法发现LINC01082与miR-18a-3p、miR-18a-3p与CADM2之间存在结合位点，且LINC01082和CADM2在癌组织中低表达，miR-18a-3p在癌组织中高表达。据此推断，LINC01082可能通过调节miR-18a-3p/CADM2轴调控ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭，从而丰富ESCC早期诊断和治疗的相关分子机制。

1 材料与方法 1.1 细胞来源

人ESCC细胞系（KYSE150和EC9706）和人正常食管上皮细胞系（SHEE）为实验室原有保存细胞系。

1.2 实验试剂

RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、

CCK-8检测试剂盒、逆转录试剂盒和双萤光素酶报告基因检测试剂盒，购自赛文创新（北京）生物科技有限公司。引物合成、LINC01082片段合成（NR_103859.1）和一代测序，由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和转染

KYSE150和EC9706细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，SHEE和293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。将生长状态良好且处于对数生长期的细胞接种至6孔板，待细胞密度介于70%~80%时进行细胞转染，完成后续实验。所有细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3.2 RNA提取、反转录和实时定量PCR

采用TRIzol法提取细胞的总RNA。RNA样品的浓度和纯度采用Nanodrop 2000（美国ThermoFisher Scientific公司）检测，并通过核酸电泳检测总RNA完整度。逆转录使用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser [宝日医生物技术（北京）有限公司）] 进行cDNA扩增。采用TB Green^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ[宝日医生物技术（北京）有限公司]和ABI StepOnePlus^TM实时PCR系统（美国Applied Biosystems公司）进行实时定量PCR，内参为GAPDH。引物序列：LINC01082，正向5’-GAGATAGGACCAACCGTCAG-3’，反向5’-AAATGTTAAGGCTGTCACTG-3’；miR-18a-3p，正向5’-ACACTCCAGCTGGGACTGCCCTAAGTGCTCC-3’，反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；CADM2，正向5’-AACAACCAGCAGCATCAG-3’，反向5’-ACAACTACAGCCACTATTCC-3’。使用2-ΔΔCt法分析RNA的相对表达水平。

1.3.3 CCK-8实验

收集转染24 h后的KYSE150细胞，以2×10³/孔的密度接种于96孔板中。在接种0、24、48、72 h后，按照CCK-8试剂盒操作说明书加入CCK-8反应液，37 ℃孵育2 h后，采用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值。

1.3.4 平板克隆形成实验

将各组细胞消化，重悬于RPMI 1640完全培养基中，以1×10³/孔的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养14 d。用4%多聚甲醛溶液对细胞克隆团进行固定，然后用0.1%结晶紫溶液染色。清洗、风干后拍照，采用ImageJ软件计数。

1.3.5 划痕实验

将各组细胞消化，均匀接种于6孔板中，待细胞长满以后，用移液器枪头在培养板上划垂直均匀的直线。用PBS清洗3~5次，去除细胞碎片。将细胞放回培养箱中继续培养，分别于0 h和24 h在同一观测点观察划痕愈合情况并拍照记录，采用ImageJ软件分析实验结果，计算细胞迁移距离。

1.3.6 Transwell实验

将各组细胞消化，悬浮于无血清的RPMI 1640培养基中，将细胞密度调整为2.5×10⁵/mL。取200 μL接种到Transwell上室，下室为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。置于培养箱中孵育24 h后，4%多聚甲醛溶液固定上室，然后用0.1%结晶紫溶液染色。随机选择5个视野进行拍照，计数细胞数量。

1.3.7 双萤光素酶报告基因实验

采用PCR扩增获得野生型（wild type，WT）和突变型（mutant，MUT）LINC01082和CADM2 3’非翻译区（untranslated region，UTR）结合位点附近cDNA片段，并将目标片段克隆至psiCHECK-2载体中。引物序列：LINC01082-WT，正向5’-CCGctcgagCAAGGCCCGGAGATAGGAC-3’，反向5’-tatgcggccgcATAATGCTCAATTTGACTTTTCCA-3’；LINC01082-MUT，正向5’-TCAACCCAGCACCGAAGAAAAACAAgtgagctAAATTATTCTTCAGC-3’，反向5’-TTCATTTCAGGCTGAAGAATAATTTagctcacTTGTTTTTCTTCGGT-3’；CADM2-3’UTR-WT，正向5’- CCGctcgagAACGTCCATTATATCCCTTTAGGT-3’，反向5’-TATgcggccgcAATGGTTAAACACGCCAAAA-3’；CADM2-3’ UTR-MUT，正向5’-ATTTACAAATTTTCATTTTGCAGTcgtgtgGCTGCTTACCTATGT-3’，反向5’-TGGCAAACCAACATAGGTAAGCAGCgacacAACTGCAAAATGAAA-3’。将miRNA mimics和WT/MUT psiCHECK-2质粒共转至293T细胞中，转染48 h后，按照试剂盒说明书检测双萤光素酶活性。

1.3.8 Western blotting

用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量。蛋白变性后，进行SDS-PAGE、转膜、封闭。一抗CADM2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，再将膜与二抗（1∶2 000）室温下孵育1 h，随后曝光检测。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析和可视化。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Student’s t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 LINC01082在ESCC组织和细胞中的表达

利用UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）在线预测ESCC中LINC01082水平，发现在不同分期的ESCC中LINC01082 mRNA的平均表达水平均低于癌旁组织，其中1期ESCC中LINC01082 mRNA表达水平显著低于癌旁组织（P < 0.05，图 1A）。通过实时定量PCR验证在正常食管上皮细胞和ESCC细胞中LINC01082 mRNA表达情况，发现EC9706和KYSE150细胞中LINC0108 mRNA表达水平显著低于SHEE细胞（P < 0.01，图 1B）。因此，后续细胞实验选择表达量较低的KYSE150细胞。

2.2 过表达LINC01082对KYSE150细胞增殖的影响

为了探讨LINC01082对细胞增殖能力的影响，利用CCK-8检测试剂盒和平板集落形成实验检测过表达LINC01082的KYSE150细胞的增殖能力，结果发现，过表达LINC01082后LINC01082 mRNA表达水平显著升高（P < 0.05，图 2A），KYSE150细胞在24、48和72 h时的细胞增殖能力均显著下降（P < 0.01，图 2B）。平板集落形成实验结果表明，过表达LINC01082后集落形成数量显著减少（P < 0.01，图 2C）。上述结果表明，过表达LINC01082后KYSE150细胞的增殖能力被抑制。

2.3 过表达LINC01082对KYSE150细胞迁移和侵袭的影响

划痕实验结果显示，过表达LINC01082后KYSE150细胞的划痕愈合率显著降低（P < 0.05，图 3A）。Transwell实验结果表明，过表达LINC01082后KYSE150穿过小室细胞数量显著降低（P < 0.01，图 3B）。上述实验结果表明，过表达LINC01082后ESCC细胞的迁移和侵袭能力降低。

2.4 LINC01082细胞定位和生物信息学分析

为了研究LINC01082潜在的作用方式，通过lnc-Locator：long non-coding RNA subcellular localization predictor网站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/）对LINC01082进行细胞定位预测，结果发现，LINC01082主要定位于细胞质。以上结果提示，LINC01082可能通过竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控机制调节下游靶基因的表达。基于此，利用LncBook 2.0、TargetScan和miRDB等软件预测LINC01082下游靶miRNA和靶基因，同时应用UALCAN数据库对靶miRNA和靶基因的差异表达进行验证。最终获得LINC01082-miR-18a-3p-CADM2调控轴，LINC01082与miR-18a-3p、miR-18a-3p与CADM2的结合位点见图 4。其中，LINC01082与miR-18a-3p的结合自由能为-16.80 kcal/mol，miR-18a-3p与CADM2的结合自由能为-13.49 kcal/mol。

2.5 miR-18a-3p和CADM2在ESCC组织和细胞中的表达

利用UALCAN数据库对ESCC中miR-18a-3p mRNA表达进行分析，结果显示，ESCC组织中miR-18a-3p mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P < 0.01，图 5A），不同分期的ESCC组织中miR-18a-3p mRNA表达水平均显著高于癌旁组织（P < 0.01，图 5B）。通过实时定量PCR验证正常食管上皮细胞和ESCC细胞中miR-18a-3p mRNA的表达情况，结果显示，KYSE150细胞中miR-18a-3p mRNA表达水平显著高于SHEE细胞（P < 0.05，图 5C）。

利用UALCAN数据库对ESCC中CADM2 mRNA表达进行分析，结果显示，ESCC组织中CADM2 mRNA表达水平低于癌旁组织（P < 0.01，图 6A），不同分期的ESCC组织中CADM2 mRNA的平均表达水平显著低于癌旁组织（P < 0.05，图 6B）。通过实时定量PCR验证正常食管上皮细胞和ESCC细胞中CADM2 mRNA的表达情况，结果显示，KYSE150细胞中CADM2 mRNA表达水平显著低于SHEE细胞（P < 0.01，图 6C）。进一步通过Western blotting检测过表达LINC01082的KYSE150细胞中CADM2蛋白表达水平，结果发现，过表达LINC01082后CADM2蛋白表达水平升高（图 6D）。

2.6 双萤光素酶报告基因实验验证LINC01082、miR-18a-3p、CADM2间的靶向关系

基于LINC01082与miR-18a-3p、miR-18a-3p与CADM2的结合位点，构建psiCHECK-2WT和MUT载体，测序鉴定后用于后续双萤光素酶实验。在转染LINC01082-WT的293T细胞中，miR-18a-3p mimic组的萤光素酶活性降低（P < 0.01）；在转染CADM2- WT的293T细胞中，miR-18a-3p mimic组的萤光素酶活性降低（P < 0.05）。其他组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 7。

3 讨论

食管癌的发生和发展受到多种因素的调节。lncRNA在食管癌的发生、发展以及转移中的作用逐渐被揭示^[10]。研究^[11]发现，LINC01082能够促进非小细胞肺癌细胞和结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。虽然LINC01082能够非侵入性诊断ESCC^[5]，但其在ESCC中的作用和分子机制仍有待进一步揭示。

本研究发现，LINC01082在ESCC组织和细胞（KYSE150细胞）中低表达，过表达LINC01082后KYSE150细胞的增殖、迁移和侵袭被显著抑制，这一结果与YANG等^[11]在非小细胞肺癌中LINC01082过表达抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的研究结果一致，表明LINCO1082可能作为一种新的肿瘤抑制剂，并可能成为ESCC治疗的潜在靶点。在细胞质中，lncRNA通过ceRNA机制与miRNA结合，间接调控下游靶RNA的表达水平，进而影响细胞功能^[12]。LINC01082的亚细胞定位预测结果显示，LINC01082在细胞质中优先分布，这表明LINC01082可能在ESCC细胞中发挥转录后功能。

本研究通过网络数据库筛选出LINC01082-miR-18a-3p-CADM2调控轴。种子序列分析、自由能分析、miR-18a-3p和CADM2在ESCC组织和细胞中的表达分析结果表明，LINC01082、miR-18a-3p和CADM2可能存在靶向关系。双萤光素酶报告基因实验确立了LINC01082、miR-18a-3p和CADM2间的靶向调控关系。

miRNA是一类高度保守、长度约为22 nt的内源性非编码RNA，其作为肿瘤抑制因子或致癌因子，在癌症的临床诊断、治疗和预后中发挥重要作用^[4]。miRNA通过在细胞质中与靶基因的3’UTR结合来降解mRNA或抑制翻译，从而负向调节下游靶基因的表达^[13-14]。研究^[15]发现，miR-18a-3p能够促进乳腺癌的进展，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在ESCC中，miR-18a可用于癌症的早期筛查，并可能成为潜在的新型生物标志物^[6-7]，但其作用和分子调控机制有待进一步揭示。本研究检测了miR-18a-3p在ESCC组织和细胞中的表达情况，结果表明，miR-18a-3p可能作为致癌因子在ESCC中发挥作用，这一结果为miR-18a-3p作用及其机制的研究提供了参考。

研究^[8]发现，CADM2是一种肿瘤抑制因子，在几种癌症中通常表达下调。还有研究^[9]发现，CADM2在ESCC组织中表达显著下调。以上研究结果与本研究的CADM2检测结果一致，表明CADM2可能作为肿瘤抑制因子在ESCC中发挥作用。

综上所述，过表达LINC01082可以抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能是通过miR-18a-3p/CADM2轴实现的。本研究为挖掘ESCC生物诊断标志物提供了新的思路。本研究的不足之处在于miR-18a-3p和CADM2的功能及其分子调控机制尚未完善，后续需要进行进一步研究。