膜性肾病以肾小球基底膜免疫复合物沉积为特征，可致蛋白尿和肾功能恶化，伴足细胞损伤，氧化应激在其发病中起关键作用^[1-2]。卫矛醇（dulcitol，Dul）是具有抗炎、抗凋亡作用的植物提取物，可缓解肠道上皮细胞炎症损伤，但其在膜性肾病中的作用尚不明确^[3-4]。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARA）主要调控脂质稳态，芯片数据提示PPARA在膜性肾病组织中表达下调，抑制PPARA可加重肾损伤^[5]。其下游靶点ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）能维持足细胞脂质平衡，减轻糖尿病肾病氧化应激^[6]。而抑制ABCA1会加重氧化应激损伤，PPARA则能够上调ABCA1，发挥协同保护作用^[7-8]。本研究拟探讨Dul通过调控PPARA/ABCA1信号通路影响氧化应激介导的膜性肾病进展机制，以期为膜性肾病的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞

40只成年雄性SD大鼠，体重（225±20）g，购自豪威生物科技有限公司，许可证号SCXK（津）2024-0002。STR鉴定的小鼠肾小球足细胞系MPC-5，购自誉弛（上海）生物科技有限公司。本研究获得天津中医药大学实验动物伦理委员会审批（TCM-LAEC2023075）。

1.1.2 试剂与仪器

Dul购自青岛多特糖醇科技有限公司；酵母多糖购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；lipofectamin 3000转染试剂购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；pcDNA3.1、pcDNA3.1-PPARA及siNC、siABCA1载体购自上海吉玛制药技术有限公司；乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性检测试剂盒、HE和Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）购自美国Med Chem Express公司；小鼠及大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；DCFH-DA荧光探针购自优利科（上海）生命科学有限公司；实时定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜购自上海碧云天生物技术股份有限公司；PPARA抗体购自武汉华美生物工程有限公司；ABCA1抗体、GAPDH抗体、HRP偶联的二抗购自艾博抗（上海）贸易有限公司；Immobilon蛋白质化学发光HRP底物购自武汉飞羿科技有限公司；阳离子牛血清蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）购自北京博蕾德生物科技有限公司。自动化学发光/荧光图像分析系统购自中国上海天能科技有限公司；全自动生化分析仪购自日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学与生物信息学分析

利用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）检索Dul（C6H14O6）获SMILES，用SwissTargetPrediction网站（http://www.swisstargetprediction.ch）与prediction网站（https://pre-diction.charite.de）预测靶点。从NCBI基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）获取GSE175759和GSE73953数据集，用GEO2R工具筛选差异基因（|logFC| > 1，P < 0.05）。从GeneCards数据库（https://www.genecards.org）筛选氧化应激靶点（评分≥6）^[9]。通过Venn图取交集，用STRING数据库（https://cn.string-db.org）构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，按中心性值与度值排名，从PDB数据库（https://www.rcsb.org）获取PPARA、NFKB1晶体，从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取Dul SDF，用AutodockVina 1.2.2对接，用PLIP分析界面，PyMOL 2.5可视化。

1.2.2 细胞培养、转染与分组

将MPC-5细胞于DMEM+10%FBS复苏后，37 ℃、5% CO₂培养分化。参照文献[10]方法制备酵母多糖活化血清（zymosan activated serum，ZAS），用8% ZAS（100 μL，亚致死C5b-9）建立足细胞亚溶破模型。在模型构建前先以Dul（30、60、90、120、150、180、200 μmol/L）预处理MPC-5细胞1 h，通过CCK-8检测，确定Dul的最佳作用浓度为180 μmol/L。细胞转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-PPARA、siNC、siABCA1并验证。将细胞分为对照、ZAS、ZAS+Dul、ZAS+pcDNA3.1、ZAS+pcDNA3.1-PPARA、ZAS+pcDNA3.1-PPARA+Dul、ZAS+pcDNA3.1-PPARA+siNC、ZAS+pcDNA3.1-PPARA+siABCA1组。转染48 h后各组进行相应干预，Dul预处理先于ZAS。

1.2.3 膜性肾病大鼠模型建立与分组

随机取8只SD大鼠为Sham组，其余32只大鼠经尾静脉梯度注射C-BSA，第1周逐日增加剂量（1 mg、1 mg、1 mg、1.5 mg、1.5 mg、2 mg和2 mg），后3周固定2.5 mg，隔日1次，构建膜性肾病模型^[11-12]。用Bradford测定试剂盒检测24 h尿蛋白（24-hour urinary protein，24 h-UTP），确认造模成功后，再随机分为Dul-L组、Dul-M组、Dul-H组及Model组，造模成功后第1天起，分别每日灌胃50 mg/kg Dul、100 mg/kg Dul、150 mg/kg Dul及等体积蒸馏水，连续4周。最后一次给药后检测24 h-UTP，全自动生化分析仪测血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.2.4 LDH释放及细胞活力、凋亡检测

超声破碎细胞（5×10⁶/mL，冰浴200 W，3 s/10 s，30次）后，离心（4 ℃，8 000 g，10 min）取上清，按照试剂盒说明书检测LDH。将细胞接种至96孔板，培养24 h后加CCK-8孵育4 h，酶标仪450 nm测吸光度。另板接种细胞（1×10⁴/孔），4% PFA固定10 min，Triton X-100通透后，TUNEL37 ℃孵育1 h，DAPI染核，荧光显微镜下采集图像，计算凋亡率。

1.2.5 氧化应激相关指标检测

4 ℃下1 000 g离心细胞20 min，取上清。用PBS冲洗并剪碎肾组织，用含蛋白酶抑制剂PBS冰浴匀浆，5 000 g离心5~10 min，取上清。按照试剂盒说明书检测上清中SOD活性及MDA含量。收集各组细胞并将其接种至96孔板，加DCFH-DA荧光探针（1∶500）37 ℃孵育20 min，用PBS洗3次。荧光显微镜下采集图像，定量活性氧（reactive oxygen species，ROS）荧光强度。

1.2.6 药物亲和反应的靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）实验

采用DARTS验证Dul与PPARA的结合。用裂解缓冲液处理MPC-5细胞30 min，提取蛋白后分为对照（含1 mL/L DMSO）组、链霉蛋白酶组、链霉蛋白酶+Dul（180 μmol/L）组，链霉蛋白酶与蛋白的混合比例为1∶20 000，室温静置10 min，加热5 min，进行Western blotting检测。

1.2.7 实时定量PCR

用TRIzol法提取各组足细胞总RNA，反转录得cDNA后，以SYBR Premix Ex Taq进行实时定量PCR。反应体系25 μL：2×Premix 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，探针1 μL，模板2 μL，无核酸水8.5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。2^-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量。GAPDH作为内参照。引物序列如下：PPARA，正向5’-GTTTGAGGGGGTAACAGCAA-3’，反向5’-GCTAACTGCAGAGGGTGAGG-3’；ABCA1，正向5’-AACAGTTTGTGGCCCTTTTG-3’，反向5’- AGTTCCAGGCTGGGGTACTT-3’；GAPDH，正向5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反向5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG -3’。

1.2.8 Western blotting

以含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解MPC-5细胞及肾组织，BCA定量后取30 μg蛋白变性，进行10% SDS-PAGE电泳并转膜，封闭后4 ℃孵育一抗（PPARA、ABCA1、GAPDH）过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，ECL显影，以GAPDH为内参照。

1.2.9 肾组织病理与免疫组织化学分析

用4%多聚甲醛固定肾组织，石蜡包埋，制5 μm厚切片，脱蜡再水化后行HE和Masson染色，光镜下观察。肾组织切片脱蜡、3% H₂O₂阻断、柠檬酸钠修复、BSA封闭，PPARA、ABCA1一抗（1∶100）4 ℃过夜，HRP二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，用Image-Pro Plus 6.0软件计算平均光密度（average optical density，AOD）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.5软件进行统计学分析。计量资料以 x±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Dul预防ZAS诱导的MPC-5细胞氧化应激损伤

与对照组相比，ZAS组细胞增殖活力降低，LDH释放水平和细胞凋亡率升高，SOD活性下降，MDA和ROS水平升高（均P < 0.05）。与ZAS组比较，Dul呈浓度依赖性促进细胞增殖，180 μmol/L效果最佳，故将该浓度用于后续实验。Dul干预后，LDH释放和细胞凋亡减少，SOD活性增强，MDA和ROS降低（均P < 0.05）。见图 1。

2.2 生物信息学分析结果

Venn图取Dul、氧化应激与膜性肾病差异基因交集获8个共同靶点（图 2A）。PPI网络按中心性值排序筛选出核心靶点NFKB1、PPARA（图 2B）。分子对接显示Dul与PPARA对接分数-5.5 kcal/mol，高于NFKB1，形成氢键，证实强结合（图 2C）。DARTS实验显示，蛋白酶组PPARA水解，Dul减少水解，证实二者结合（图 2D）。Western blotting结果显示，ZAS降低了PPARA表达水平，而Dul提高了PPARA表达水平（P < 0.001）（图 2E）。

2.3 上调PPARA改善ZAS诱导的MPC-5细胞损伤与氧化应激

实时定量PCR结果显示，pcDNA3.1-PPARA转染显著上调PPARA mRNA表达水平（P < 0.05），证实转染成功。ZAS组较对照组PPARA蛋白表达减弱，细胞增殖活力降低、LDH水平升高、细胞凋亡增加、SOD活性下降、MDA和ROS水平升高（均P < 0.05）；pcDNA3.1转染无改善作用。ZAS+pcDNA3.1-PPARA组较ZAS+pcDNA3.1组PPARA蛋白表达增强，增殖活力上调、LDH水平降低、细胞凋亡下降、SOD活性升高、MDA和ROS水平降低（均P < 0.05）；联合Dul干预则进一步增强了以上保护作用（均P < 0.05）。见图 3。

2.4 敲减ABCA1逆转上调PPARA对ZAS诱导的MPC-5细胞损伤的保护作用

实时定量PCR结果显示，siABCA1使ABCA1 mRNA表达水平显著下调，siNC无此作用（P < 0.05）。ZAS+pcDNA3.1-PPARA组较ZAS+pcDNA3.1组ABCA1蛋白表达水平升高，细胞活力提高，LDH降低，细胞凋亡减少，SOD上调，MDA和ROS降低。ZAS+pcDNA3.1-PPARA+siABCA1组较ZAS+pcDNA3.1-PPARA+siNC组则呈相反效应（均P < 0.05）。见图 4。

2.5 Dul改善膜性肾病大鼠模型肾损伤程度

结果显示，Model组大鼠24 h-UTP及血清BUN与Scr均较Sham组升高，Dul干预后则显著降低（均P < 0.05）。HE和Masson染色显示，Sham组肾结构正常，Model组肾小球呈双轨征，肾小管变性、间质纤维化，Dul干预改善了以上病理损伤。此外，与Sham组比较，Model组肾组织SOD活性降低，MDA与ROS水平升高，PPARA与ABCA1 AOD值下降；Dul干预后SOD活性升高，MDA与ROS水平降低，PPARA、ABCA1 AOD值增加（均P < 0.05）。见图 5。

3 讨论

ZAS诱导足细胞损伤模型的核心病理机制为补体激活产物C5b-9沉积，可在24 h内稳定复制膜性肾病关键表型，使足细胞特异性蛋白（podocin、nephrin、WT-1）表达下调，以及足突回缩、易脱落等^[13]。C-BSA诱导的膜性肾病大鼠模型出现高脂血症、低蛋白血症和严重蛋白尿，可模拟人类疾病发展过程^[14-15]。

本研究中，ZAS组细胞增殖活力降低、LDH释放与凋亡增加，Model组大鼠肾功能损伤加重，病理呈典型膜性肾病特征，证实模型构建成功。结合生物信息学分析结果，Dul可能通过调控PPARA/ABCA1信号通路减轻氧化应激和肾功能损害。

在膜性肾病中，炎症细胞过度产生ROS，可加剧炎症反应，导致组织和肾病进展；氧化应激影响足细胞功能，损害肾小球滤过屏障的完整性，导致蛋白尿；此外，包括SOD在内的抗氧化系统活性减弱，可导致氧化应激进一步增加，从而加剧慢性肾病进展^[12]。在胶质瘤中，Dul能够通过诱导肿瘤细胞中的氧化应激，抑制细胞自噬，促进细胞凋亡，并提高胶质瘤模型大鼠的生存率^[16]。本研究无论是在体外细胞模型还是大鼠模型中，均呈现SOD水平下降、MDA与ROS生成增加，这些变化加剧了细胞的氧化损伤和肾组织的病理损害。然而，Dul作为一种有效的抗氧化剂，能够显著抑制由ZAS诱导的氧化应激反应，不仅提升了SOD的活性，降低了MDA和ROS的水平，还有效改善了肾组织的病理状态，在体外和体内模型中均展现出对膜性肾病的保护作用。

PPARA是一种核转录因子，在近曲小管细胞中高度表达，具有调节脂质和葡萄糖代谢以及炎症反应的作用，在糖尿病肾病和膜性肾病纤维化组织中其表达下降^[17-18]。ABCA1在足细胞中表达降低，可通过炎性小体途径促进肾损伤^[19]。PPARA激活可增加ABCA1表达，促进胆固醇外流，改善糖脂紊乱^[20]。此外，PPARγ与LXRα-ABCA1通路共同作用也可降低氧化应激水平^[21]。本研究中分子对接结果显示，Dul与PPARA结合力较强，并促进PPARA蛋白表达。本研究还发现，当在足细胞中过表达PPARA时，ABCA1 mRNA表达水平显著增强，同时ZAS诱导的足细胞增殖活力改善、凋亡减少，氧化应激水平降低。提示PPARA可能通过某种机制促进ABCA1的表达，从而降低氧化应激程度。

综上所述，PPARA/ABCA1信号通路在膜性肾病中发挥着重要作用，而Dul可能通过促进PPARA/ABCA1信号通路的激活，抑制膜性肾病中的氧化应激，并改善肾损伤。因此，开发能够激活PPARA/ABCA1信号通路的药物，如Dul或其衍生物，可能有助于治疗膜性肾病，本研究结果为膜性肾病的药物研发提供了新的思路。