细胞消融是一种根据特定细胞群内在特征设计的、诱导细胞群发生死亡的技术。由于不同的细胞群在可及性和内在特性上存在较大差异，目前尚无能够适用于所有细胞群的消融方法^[1]。本文总结了目前常用的细胞消融方法的特点，以帮助科研人员选择合适的细胞消融方法。

神经生物学研究涉及的主要细胞类型包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞等^[2]。细胞消融对于神经生物学研究十分重要，是深入了解神经系统中特定细胞群功能的重要手段。本文总结了不同细胞消融方法在神经生物学研究中的最新应用，为神经生物学相关研究提供参考。

1 细胞消融方法

细胞消融是研究器官发生、组织稳态和再生过程中细胞功能的有效方法。目前，常用的细胞消融方法主要包括遗传学消融、光学消融、化学消融和多重联合消融等。

1.1 遗传学消融

遗传学消融是目前使用较广泛的一类细胞消融方法，具有很高的细胞群特异性。遗传学消融主要通过基因编辑技术，使细胞毒素或毒素受体在靶细胞群特异性表达，从而实现消融特定细胞群的目的。

1.1.1 白喉毒素（diphtheria toxin，DT）介导的遗传学细胞消融

DT是一种由白喉棒状杆菌产生的外毒素，由A、B两个亚基组成，其中A亚基（DT-A）能够导致负责蛋白质合成的延长因子2失活，阻断蛋白质合成，导致细胞死亡；B亚基能够与细胞表面的白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）结合，介导DT-A进入细胞^[1]。作为常用的实验动物，小鼠本身不表达DTR^[2]。因此，通过在小鼠的靶细胞中表达人源DTR基因或者DT-A基因，可以实现细胞的特异性消融。对于DTR介导的细胞消融，首先需要利用转基因手段在靶细胞群中表达人源DTR基因，然后再对获得的转基因小鼠进行DT注射，从而实现靶细胞的清除；该方法的优点是表达的DTR本身无毒性，缺点是注射的高剂量DT可能造成非特异性细胞死亡。相对而言，DT-A介导的细胞消融安全性更高，其直接在细胞内抑制蛋白质合成，不需要进行DT注射，该技术已被广泛用于脑内神经元^[3]和胶质细胞的消融^[4]。

1.1.2 前体药物代谢酶介导的遗传学细胞消融

前体药物代谢酶介导的细胞消融是一种通过联合应用代谢酶的遗传表达与前体药物来杀死细胞的技术手段，该代谢酶可以作用于本身无活性或者活性很弱的前体药物，使其在生物体内转化为具有药理活性的细胞毒性物质。通过遗传学手段，使前体药物代谢酶在细胞中特异表达，即可实现特定细胞群的消融。

单纯疱疹病毒胸苷激酶是该消融方法中应用较广泛的一种前体药物代谢酶^[5]。单纯疱疹病毒胸苷激酶能够磷酸化人核苷类似物更昔洛韦，通过位阻效应抑制增殖细胞的DNA合成，导致细胞死亡^[6]。另一种常用的药物代谢酶是大肠杆菌分泌的硝基还原酶，它可以将前体药物转变成导致DNA损伤的细胞毒性代谢物^[7]，从而诱导细胞消融。该方法已用于消融神经元^[8]和周细胞^[9]。

1.1.3 胱天蛋白酶（caspase）介导的遗传学细胞消融

在真核细胞发生细胞凋亡时，细胞内成分逐渐被降解，很少造成炎症以及损害周围细胞。因此，人为诱导靶细胞出现细胞凋亡也是一种理想的细胞消融方式。caspase在细胞凋亡的发生中起关键作用^[10]。有研究^[11]采用化学方法诱导caspase发生二聚化，使其形成活化型caspase，从而诱导靶细胞发生细胞凋亡，以实现细胞消融。最近，表达caspase的腺相关病毒诱导的遗传学消融已被用于小鼠的神经元消融^[12-13]。

1.2 光学消融

光学消融基于将光能转化为热能的原理，利用激光破坏细胞中的蛋白质，可在数秒内导致细胞死亡^[14]。通过将光学消融与显微镜技术结合，能够实现单细胞分辨率的细胞消融。双光子激光是光学消融的首选激光，能够实现高精度照射特定区域细胞，从而消融照射范围内的细胞^[15]。光学消融近年来已被用于脑微血管内皮细胞^[16]和周细胞^[17]的消融。由于光学消融需要与显微镜技术相结合，因此光学消融主要用于早期发育阶段以及局部组织中少数或单个细胞的功能研究，不太适用于组织深层细胞以及大范围细胞的消融^[18]。

1.3 化学消融

一些细胞群体的存活特别容易受到某些特殊化学药物的影响，因此这些化学药物可以用来靶向消除敏感的细胞。氯磷酸脂质体是人工合成的包裹着氯磷酸盐的脂质囊泡，其被注射到生物体内后可诱发单核细胞和巨噬细胞发生凋亡^[19]。由于氯磷酸脂质体半衰期较短以及单核细胞和巨噬细胞再生速度较快，可能导致细胞清除与细胞再生同时发生，因此氯磷酸脂质体的应用受限^[20]。小胶质细胞的发育和存活依赖于集落刺激因子1（colonystimulating factor 1，CSF1）^[21]，因此CSF1受体抑制剂（如PLX5622、PLX3397）可以用于特异性消融小胶质细胞。由于CSF1受体抑制剂被吸收后可以转运入脑，因此口服给药即可实现对脑内小胶质细胞的消融。一些神经毒素可以用于神经元消融，如交感神经肾上腺素能传递的抑制剂6-羟多巴胺以及独立作用于蓝斑核神经元的神经毒素N-（2-氯乙基）-N-乙基-2-溴苄^[22]。化学消融的优点为对于一些毒素敏感的细胞可以实现特异性消融，但是其消融细胞的独特机制也限制了其更广泛的应用。

1.4 多重联合消融

目前，常用的多重联合消融包括光学与遗传学的联合消融（即光遗传学消融）以及光学与化学的联合消融（即光化学消融）。光遗传学消融首先通过转基因技术在细胞中表达光敏分子（如红色荧光蛋白KillerRed^[16]和绿色荧光蛋白MiniSOG^[23]），然后利用激光对靶细胞进行照射，激发细胞产生活性氧，诱发细胞死亡，从而达到消除细胞的目的。caspase也被用于进行光遗传学消融^[24]。双光子化学凋亡靶向消融^[25]是一种光化学消融方法，该方法通过局部注射核酸强结合染料，然后使用飞秒脉冲激光进行照射，从而实现单个细胞的剂量依赖性凋亡。

光遗传学与光化学消融方法均可以实现单个细胞分辨率下的细胞消融。联合消融使用的光强度远低于上述的单纯光学消融使用的光强度，从而避免或最大限度地减少非特异性组织损伤。

2 细胞消融在神经生物学研究中的应用

神经生物学研究涉及的主要细胞类型包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞和周细胞^[26-27]。下面简要叙述细胞消融在神经生物学相关的细胞功能研究中的应用：

2.1 细胞消融在小胶质细胞中的应用

小胶质细胞的消融有助于研究其在神经炎症和神经退行性变中的作用^[4]。目前，小胶质细胞的消融主要采用化学消融和遗传学消融，化学消融主要采用CSF1R抑制剂和氯磷酸脂质体。在CSF1R抑制剂介导的小胶质细胞消融研究中，持续给予CSF1R抑制剂可以维持脑内极低水平的小胶质细胞，停止给药后小胶质细胞可以快速重新增殖^[28]；由于氯磷酸脂质体无法通过血脑屏障，因此氯磷酸脂质体介导的小胶质细胞消融需要将氯磷酸脂质体注射到小鼠脑内。遗传学消融主要通过遗传编码DTR，从而实现小胶质细胞的消融。在Cx3cr1-CreER-DTR小鼠中，99%的小胶质细胞在暴露于DT后被消除^[29]。研究^[30]显示，通过消融使小胶质细胞再繁殖的策略可以减少阿尔茨海默病小鼠模型中神经元变性和神经炎症，改善小鼠的认知和行为。

2.2 细胞消融在星形胶质细胞中的应用

针对脑内星形胶质细胞的细胞消融方法主要包括遗传学消融、化学消融和光化学消融等。遗传学消融主要利用星形胶质细胞特异性启动子构建GFAP-CreERT2-DTA^[31]小鼠，实现星形胶质细胞消融。化学消融主要利用星形胶质细胞特异性毒素L-α-氨基己二酸^[32]。在光化学消融中，可以利用双光子化学凋亡靶向消融对星形胶质细胞进行消融。应用双光子化学凋亡靶向消融对星形胶质细胞进行消融时，其周围的星形胶质细胞会不断延伸以覆盖血管^[33]。此外，已有研究^[34]报道，通过遗传编码选择性消融小鼠出生后的Hmgb1⁺星形胶质细胞，会造成星形胶质细胞形态和端足位置变化以及内皮超微结构严重破坏。星形胶质细胞消融后血管形态结构的改变，揭示了其对维持血管结构和功能的重要作用。

2.3 细胞消融在少突胶质细胞中的应用

少突胶质细胞消融的方法比较单一，主要是通过遗传学消融，利用少突胶质细胞特异性启动子构建Plp-CreERT2-DTA小鼠，诱导少突胶质细胞特异表达DTA，从而实现少突胶质细胞的消融。消融造成的少突胶质细胞死亡可导致原发性脱髓鞘，伴有持续的继发性轴突损伤和随后的自发性髓鞘再生^[35]。NG2⁺胶质细胞是少突胶质细胞谱系的一部分，并且在整个生命周期中不断产生成熟的髓鞘少突胶质细胞^[36]。应用遗传学消融构建NG2-CreERT2-DTA小鼠，可以实现NG2⁺胶质细胞消融。研究^[35]表明，消除NG2⁺胶质细胞后，在炎症刺激下，小鼠小胶质细胞表现出特征基因显著变化和炎症反应，揭示了NG2⁺胶质细胞在神经炎症中的新功能。

2.4 细胞消融在周细胞中的应用

周细胞是覆盖在脑微血管基底侧的重要细胞类型，与星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞协同调节血脑屏障功能^[37]。周细胞的消融主要通过遗传学消融和光学消融实现。有研究构建了pdgfr-β-CreERT2-DTA小鼠^[38]，被用于脑膜炎小鼠周细胞的遗传学消融^[39]。对周细胞进行遗传学消融后，能够导致周细胞进行性减少、血流量显著减少、血脑屏障破坏伴随神经退行性病变^[40]。在光学消融周细胞的研究^[41]中，通过激光靶向消融局部血管的周细胞，结果发现急性单个周细胞的消融能够导致局部暂时性血管张力丧失和毛细血管扩张。

2.5 细胞消融在神经元中的应用

由于神经元功能受电活动的影响，在神经元功能研究中细胞消融通常被作为辅助策略，如利用caspase-3介导的遗传消融可以消融大脑腹侧被盖区谷氨酸能神经元^[13]。局部注射条件性表达caspase-3的腺相关病毒，可以实现儿茶酚胺能神经元的局部消融^[12]。此外，有研究^[42]采用遗传学消融对γ-氨基丁酸神经元进行消融，可导致小鼠行动能力增强以及觉醒增加。

目前，细胞消融已被广泛用于神经生物学研究中相关细胞的消融。需要注意的是，在对细胞进行化学消融和遗传学消融时，要考虑到化学或者遗传学消融中使用的药物是否可以穿过血脑屏障，同时还应根据实际情况调整药物剂量和给药次数。

3 细胞消融在神经系统疾病中的应用

为了探究不同细胞类群在神经系统疾病发生和发展中的功能，研究人员尝试在不同神经系统疾病研究中应用细胞消融。此外，细胞消融在神经系统疾病中的应用也使靶向细胞治疗成为可能。

3.1 神经系统疾病模型的构建

细胞消融可以用于神经系统疾病模型的构建。如在帕金森病中，多巴胺神经元的丢失是该病的重要表现^[43]，因此，通过脑内注射多巴胺神经元敏感性的神经毒素6-羟多巴胺，可消除多巴胺能神经元，构建帕金森病的动物模型^{[27, 44]}。另外，通过遗传编码毒素消融少突胶质细胞也可以引起脱髓鞘表型，构建多发性硬化症模型^[35]。

3.2 神经系统疾病机制的研究

研究人员利用细胞消融，揭示了特定细胞在神经系统疾病发展中的关键作用。在肌萎缩侧索硬化中，功能失调的星形胶质细胞失去了促进神经元存活和突触发生的能力，对星形胶质细胞进行选择性消融和替代后，肌萎缩侧索硬化的症状明显改善^[45]，说明星形胶质细胞在肌萎缩侧索硬化中具有重要作用。此外，有研究^[46-47]报道了小胶质细胞消融可避免多种神经退行性变中神经元丢失和萎缩。

3.3 神经系统疾病的实验性治疗

细胞消融已被尝试用于神经退行性变治疗。应用细胞消融对小胶质细胞进行消融和再繁殖后，再繁殖的小胶质细胞可以改善阿尔茨海默病中神经退行性变和神经炎症，还能改善认知和运动功能，发挥保护性作用^[48]。在肌萎缩侧索硬化的研究中，小胶质细胞的消融和再繁殖改善了神经细胞的微环境^[49]。在脑外伤和衰老等病理条件下，应用细胞消融对小胶质细胞进行消融再繁殖后，在全身的免疫反应中再繁殖的小胶质细胞表现出与原有小胶质细胞不同的活性^[50]。这些研究均揭示了特异性细胞消融在神经系统疾病中的治疗潜力。

4 总结与展望

目前，多种细胞消融方法已被开发，研究人员应用多种细胞消融方法对神经系统中的不同靶细胞功能进行了大量研究。本文总结了细胞消融在多种细胞中的应用，并探讨了细胞消融方法对神经系统疾病的影响。细胞消融再繁殖策略为了解神经系统疾病中特定细胞的作用提供了手段，并为潜在的治疗策略提供了新思路。应用细胞消融已经可以深入了解神经细胞的功能，并有助于更好地了解它们在生理和病理状态下在神经系统中的具体作用。未来细胞消融可能被进一步用于研究神经系统细胞间的相互作用，并被作为神经系统疾病的潜在治疗方法。