肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最为常见的类型，近年来其发病率和死亡率持续上升^[1-2]。肿瘤细胞的浸润和转移是导致LUAD治疗失败的主要原因，而肿瘤干细胞的存在则是肿瘤复发和耐药的根源^[3-5]。与此同时，肿瘤细胞通过免疫逃逸机制抑制免疫系统的抗肿瘤作用，进一步加剧了治疗的困难^[6]。此外，肿瘤微环境的复杂性，包括低氧、免疫抑制和基质改变，也使得LUAD的治疗更加艰难^[7-8]。

前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）能够通过激活其受体（prostaglandin D2 receptor，PTGDR2），抑制肿瘤细胞的增殖和转移，还可能通过减少肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）相关的免疫逃逸和免疫抑制信号，改善肿瘤免疫微环境，提高机体对肿瘤的免疫应答能力^[9-13]。因此，PGD2/PTGDR2通路可能成为抑制CSC及改善肿瘤免疫微环境的潜在治疗靶点。本研究拟探讨PTGDR2在LUAD进展中的作用及其通过自噬调控CSC干性的靶向潜力，以期为PTGDR2在临床治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

用含10% FBS和10 mg/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），在37 ℃、5%CO₂培养箱中，培养人LUAD细胞系A549（购自中国科学院细胞库）。每72 h换液1次。取对数生长期细胞用于本研究。

1.2 细胞转染及分组

利用siRNA技术沉默PTGDR2，靶向PTGDR2的siRNA（大连瑞真生物技术有限公司）序列为5’-UCAACACGGUGCCCUAUUUTT-3 ’。转染前24 h接种A549细胞至24孔板（5×10⁴/孔），待细胞生长达到30%~50%融合时，用lipofectamine 3000、Opti-MEM™培养基及50 nmol/L siPTGDR2或siNC进行细胞转染，在37 ℃、5%CO₂培养箱中继续培养18~48 h。将A549细胞随机分为5组：（1）siNC组，仅转染siNC；（2）siNC+PGD2组，用2 μg/mL PGD2处理siNC转染细胞；（3）siPTGDR2组，仅转染siPTGDR2；（4）siPTGDR2+PGD2组，用2 μg/mL PGD2处理siPTGDR2转染细胞；（5）siPTGDR2+PGD2+RAPA组，用2 μg/mL PGD2及20 μmol/L细胞自噬激动剂RAPA处理siPTGDR2转染细胞。

1.3 细胞迁移能力检测

将siNC组、siNC+PGD2组、siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组细胞按照5×10⁴/孔的密度，接种至Transwell上室。在Transwell上室添加无血清RPMI1640培养基，下室添加含1% FBS的培养基，培养24 h。取出小室，结晶紫染色，用PBS清洗。光学显微镜下观察并拍照，用ImageJ软件计算迁移细胞所占面积。

1.4 细胞增殖能力检测

按照1×10⁴/孔的密度，将siNC组、siNC+PGD2组、siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组细胞接种至24孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养1、3、5 d。在显微镜下计数细胞数，并计算增殖率。细胞增殖率=（实验组细胞数-对照组细胞数）/对照组细胞数×100%。

1.5 CSC标志物分析

siNC组、siNC+PGD2组、siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组细胞培养3 d后，进行CSC表面抗原CD166染色，通过流式细胞术分析CSC标志物CD166阳性率。

1.6 实时PCR

使用RNeasy Mini Kit（美国Qiagen公司）提取5组细胞总RNA，逆转录cDNA，进行实时PCR。PCR反应体系：2×SYBR^® Green Pro Taq HS Premix 20 μL，cDNA 2 μL，Primer F（10 μmol/L）0.4 μL，Primer R（10 μmol/L）0.4 μL，RNase free water 7.2 μL。GAPDH作内参照。引物序列如下：LC3B，正向5’-AGCAGCATCCAACCAAAATC-3’，反向5’-CTGTGTCCGTTCACCAACAG-3’；CD166，正向5’-TGGCTGTGTTTGAGATTGCC-3’，反向5’-TGGCGTAGTGTTGGTTCTGA-3’；OCT4，正向5’-GAGGAGTCCCAGGACATGAA-3’，反向5’-GGAGACCCAGCAGCCTCAAA-3’；GAPDH，正向5’-TTCCACCTTTGATGCTGGGG-3’，反向5’-CCATGTAGGCCATGAGGTCC-3’。采用2^-ΔΔCt法计算自噬及CSC相关基因的相对表达量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用方差分析。计数资料用率（%）表示，采用χ²检验进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CSC表面抗原CD166染色结果

与siNC组细胞（52%±4.2%）相比，siNC+PGD2组细胞（38%±3.4%）CD166表达水平降低，siPTGDR2组细胞（76%±8.6%）和siPTGDR2+PDG2组细胞（62%±5.7%）CD166表达水平升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。siPTGDR2+PDG2组细胞CD166表达水平与siPTGDR2组细胞比较无显著差异。提示PGD2可能通过其受体PTGDR2抑制CD166的表达，调控CSC特性。见图 1。

2.2 PDG2/PTDGR2对A549细胞自噬及CSC相关基因表达的影响

实时PCR结果显示，与siNC组相比，siNC+PGD2组自噬相关基因LC3B mRNA表达水平升高，siPTGDR2组LC3B mRNA表达水平降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。提示PGD2/PTGDR2信号可促进LUAD细胞自噬。见图 2A。与siNC组相比，siNC+PGD2组CSC相关基因CD166、OCT4 mRNA表达水平降低；siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组和siPTGDR2+PGD2+RAPA组CD166、OCT4 mRNA表达水较siNC+PGD2组升高；siPTGDR2+PGD2+RAPA组CD166、OCT4 mRNA表达水平则较siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。说明PGD2诱导的CSC抑制作用由于敲低PTGDR2而消失，而自噬激活剂RAPA可增加CD166和OCT4的表达。提示自噬激动剂RAPA能够部分逆转PTGDR2缺失带来的CSC特性增强现象，进一步证实了PTGDR2在自噬与CSC特性调控中的重要作用，见图 2B。

2.3 PDG2/PDGR2对A549细胞迁移及增殖的影响

Transwell实验结果显示，与siNC组细胞比较，siNC+PGD2组细胞迁移能力下降，siPTGDR2组、siPTGDR2+PGD2组细胞迁移能力增加，siPTGDR2+PGD2组细胞迁移能力较siPTGDR2组降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图 3A、3B。

对培养1、3、5 d的4组细胞进行计数并计算增殖率，结果显示，与siNC组比较，siNC+PGD2组细胞增殖率降低；与siNC+PGD2组比较，siPTGDR2组细胞增殖率升高；与siPTGDR2组比较，siPTGDR2+PGD2组细胞增殖率降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。提示PGD2通过其受体PTGDR2抑制了LUAD细胞A549的增殖与迁移，而敲低PTGDR2可抵消这种抑制。见图 3C。

3 讨论

PTGDR2作为G蛋白偶联受体家族成员，具有抗肿瘤特性。PTGDR2在LUAD、胃癌等实体肿瘤中普遍呈低表达，且其表达水平与患者的预后呈正相关^[9-11]。PGD2能够通过激活其受体PTGDR2抑制CSC，主要机制包括以下2个方面：通过抑制STAT3的磷酸化和核转位，下调CSC相关基因的表达，削弱其自我更新能力；PTGDR2与E3泛素连接酶RNF5竞争结合ATG4B，促进自噬相关蛋白表达，激活自噬通路，从而进一步抑制CSC^[10-13]。此外，PTGDR2的低表达还可能影响肿瘤微环境的免疫逃逸机制^[14-17]。因此，PGD2/PTGDR2通路可能成为抑制CSC及改善肿瘤免疫微环境的潜在治疗靶点。

研究发现，胃癌组织中L-PTGDS/PTGDR2表达显著下调，且与CSC标志物（Sall4、Lgr5）的表达呈显著负相关。PTGDR2沉默可增强CSC自我更新能力，而外源性PGD2刺激或L-PTGDS过表达则能有效抑制CSC。PGD2/PTGDR2信号通路通过特异性阻断STAT3 Thr705位点磷酸化，抑制其核转位及转录激活功能，从而下调CSC相关基因表达^[12]。本研究中，敲低PTGDR2后，A549细胞的CSC相关基因CD166和OCT4的表达上调，自噬相关基因LC3B表达下调，表明PTGDR2通过自噬调控轴抑制了A549细胞的CSC特性。自噬激动剂RAPA的干预能够部分逆转PTGDR2敲除带来的CSC干性增强，从而进一步证实了PTGDR2在自噬与CSC调控中的重要作用。相比以往在胃癌等肿瘤模型中关于PTGDR2调控STAT3磷酸化或维持CSC特性的研究^[11-12]，本研究结果拓展了PTGD2/PTGDR2信号通路在自噬调控方面的作用。

研究发现，PTGDR2的低表达与肿瘤增殖和转移相关，PGD2可通过PTGDR2依赖性方式显著抑制肿瘤生长及转移，且可被PTGDR2敲除完全逆转。因此，PTGDR2在PGD2介导的抗肿瘤效应中发挥着关键作用。本研究结果显示，PGD2通过PTGDR2抑制了LUAD细胞A549的增殖和迁移，而这一作用在PTGDR2敲除后被显著抵消。

综上所述，PTGDR2在LUAD的进展中发挥重要作用。PTGDR2能够通过激活PGD2/PTGDR2信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及CSC特性，并通过促进自噬抑制肿瘤进展。本研究结果为PTGDR2作为LUAD的治疗靶点提供了理论依据，并为PTGDR2激动剂在LUAD的临床治疗，尤其是在联合免疫治疗中的应用，提供了新的思路。