结肠癌是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤。我国结肠癌发病率和死亡率均位居前列^[1]。癌细胞耐药对结肠癌临床治疗的影响日益凸显，不仅降低了化疗药物的治疗效果，还可能加剧不良反应，影响患者的生活质量^[2]。研究^[3]表明，肿瘤来源的乳酸（lactic acid Lac）对结肠癌进展具有显著影响；缺氧环境下结直肠癌细胞中Lac水平升高，这不仅促进了癌细胞的生长和转移，还促进了肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）M2极化。

SRY盒转录因子9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）是一种重要的转录因子，参与多种生理病理调控。近年来研究^[4]发现SOX9在肺癌中通过促进细胞干性、迁移和侵袭，以及参与糖酵解过程促进了肺癌进展。肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）作为Wnt/β-连环蛋白信号传导的关键调节因子，通过靶向TRAF2能够抑制致癌Wnt/β-连环蛋白信号传导，在结肠癌的发生和进展中起到了重要作用^[5]。在抗病毒信号转导中，SOX9通过抑制TRAF2泛素化促进TRAF2的表达^[6]。然而，SOX9-TRAF2信号通路在结肠癌中的作用机制尚未明确。本研究探讨Lac激活TAMs中SOX9-TRAF2信号通路对结肠癌化疗耐药的影响。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

15只5~6周龄、体重22~22g BALB/c雄性小鼠[赛业（苏州）生物科技有限公司，许可证号SCXK（苏）2022-0016]；人结肠癌细胞系SW480、人单核细胞白血病细胞系THP-1、RPMI 1640培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0223A、CL-0233、PM150110P）；5-氟尿嘧啶（5 -fluorouracil，5-FU）、佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，F6627、P8139]；lipofectamine 3000转染试剂（美国赛默飞世尔科技公司，11668030）；si-SOX9质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；MTT试剂盒、TUNEL试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司，C0009S、C1086、P0009、P0012、FFP19、P0018）；MG-132、RIPA裂解液（美国MedChemExpress公司，HY-13259、HY-K1001）；LDHA抗体、LAMP2抗体（美国Cell Signaling Technology公司，2012S、34141S）；SOX9抗体、TRAF2抗体、GAPDH抗体、山羊抗兔IgG H&L（英国abcam公司，ab26414、ab308019、ab181602、ab6702）；人转化生长因子β（human transforming growth factor β，TGF-β）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）ELISA试剂盒（上海酶联科技生物有限公司，ml064258、ml038176）；电泳系统、多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）；电子显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学预测

利用GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）预测SOX9在结肠癌中的表达水平以及SOX9和TRAF2在结肠癌中表达的相关性。利用Ubibrowser网站（http://ubibrowser.bio-it.cn/ubibrowser/home/index）预测与SOX9存在泛素化连接关系的分子。

1.2.2 5-FU耐药细胞系建立

SW480细胞培养在含有10%FBS+1%P/S的DMEM培养基中，培养条件为5% CO₂、37℃。采用梯度暴露法构建结肠癌耐药细胞系（SW480-R）。首先，将SW480细胞暴露于5μmol/L~2 mmol/L递增浓度的5-FU。在初始阶段，向细胞生长培养基中加入低浓度5-FU，随后移除因药物作用而死亡的细胞。然后将存活的细胞培养在不含5-FU的正常培养基中，直至细胞融合达到70%~80%，再次向培养基中加入更高浓度5-FU。重复上述步骤，直至细胞逐渐适应高浓度5-FU环境，建立对5-FU具有耐药性的细胞系。

1.2.3 细胞培养与处理

THP-1细胞培养在含有10% FBS、1%P/S、0.05mmol/L β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中，培养条件为95%空气、5%CO₂、37℃。在37 ℃条件下，用150nmol/L PMA处理THP-1细胞，持续48 h，诱导M0巨噬细胞。

将M0巨噬细胞与不同浓度（0、5、10、20mmol/L）Lac共同孵育6h，分析Lac对巨噬细胞极化的影响。300 g离心10min收集SW480和SW480-R细胞上清液，进一步以2000 g离心20min获得条件培养基（conditioned medium，CM；SW480-CM、SW480-R-CM）并干预M0巨噬细胞。0、20mmol/LLac处理M0细胞，300 g离心10min收集细胞上清液，进一步以2000 g离心20 min获得对应的CM（0mmol/L Lac-CM、20mmol/L Lac-CM）并干预SW480和SW480-R细胞24h。Lac浓度梯度以及Lac的处理时间参考文献[3]。

1.2.4 细胞转染

按照lipofectamine 3000转染试剂说明书将si-SOX9质粒转染至M0巨噬细胞与SW480-R细胞中，转染持续48h。

1.2.5 MTT检测细胞活力

根据MTT试剂盒说明书配制浓度为5mg/mL的MTT溶液。随后，在96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬液（2000个细胞）。接着向孔中加入经过Lac处理的M0细胞CM，或者不同浓度的5-FU（1、2、3、4mmol/L）。然后向每孔加入100 μL MTT溶液，将培养板放入细胞培养箱中孵育4h。孵育结束后，每孔加入100μL溶解液，混匀孵育直至紫色结晶完全溶解。最后使用酶标仪在570nm波长处测量各孔的吸光度值。

1.2.6 Transwell检测细胞迁移

当细胞生长至约80%融合时，将培养基更换为无血清培养基。12h后根据实验分组对细胞进行相应处理，24h后对细胞进行消化和离心。使用无血清培养基悬浮细胞，并调整细胞浓度至5×10⁵/mL。在Transwell上室加入200μL细胞悬液，下室则加入含有10%胎牛血清的培养基。将细胞在培养箱中孵育24h后取出上室，轻轻擦去上室内面未迁移的细胞。接着，使用无水甲醇固定细胞10min，随后用0.1%结晶紫染色。显微镜下随机选择6个视野，拍照并记录细胞迁移情况。以空白对照组的细胞迁移数量作为基准（设为100%），统计并计算各实验组细胞迁移数量的百分比。

1.2.7 His pull-down实验测定泛素化水平

His pulldown实验用于验证SOX9对TRAF2的泛素化修饰。首先使用His pull-down裂解缓冲液对转染SOX9过表达质粒的M0巨噬细胞进行裂解，裂解时间2h。之后在裂解物中加入50μL Ni NTA珠并在室温孵育6h。His pull-down缓冲液对珠子进行洗脱，并且借助30 μL 2×SDS缓冲液煮沸，最后进行Western blotting检测。

1.2.8 Western blotting检测

收集各组细胞并使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液进行处理，裂解获得的蛋白样品经过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。随后，将40μg蛋白样本加载到10%SDSPAGE凝胶中，通过电泳分离蛋白质。接着，将分离后的蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。室温下使用5%BSA将膜封闭1~2h。将膜与特异性一抗[LDHA抗体（1 ∶ 1 000）、LAMP2抗体（1 ∶ 1 000）、SOX9抗体（1 ∶ 1 000）、TRAF2抗体（1 ∶ 1 000）、GAPDH抗体（1 ∶ 10 000）] 在新鲜封闭缓冲液中4℃孵育过夜，PBS洗涤去除未结合的一抗。将膜与山羊抗兔IgG H&L（1 ∶ 1 000）室温下孵育1h，使用超敏ECL化学发光试剂盒进行化学发光检测，对目的蛋白进行可视化分析。

1.2.9 ELISA检测TGF-β和Arg1

收集各组细胞样品，1000 g离心20min，获得上清液。收集小鼠结肠癌组织，按照1∶9重量体积比加入PBS，使用匀浆器将组织于冰上研磨充分，超声破碎，5000g离心10 min，获得上清液。按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中TGF-β和Arg1水平。

1.2.10 异种移植肿瘤模型

将15只BALB/c雄性小鼠喂养在无特定病原体（SPF）环境中，模拟12h明暗周期。喂养1周后在小鼠腋窝处皮下注射1×10⁷个SW480细胞诱导异种移植瘤。1周后局部剃毛测量肿瘤体积，小鼠肿瘤体积约为100mm³提示建模成功。然后将小鼠分为对照组（每隔3d腹腔注射与5-FU等体积的生理盐水）、5-FU组（每隔3d腹腔注射25mg/kg的5-FU）、5-FU+Lac组（每隔3d腹腔注射25 mg/kg的5-FU，并同时向肿瘤周围注射20mmol/L Lac），每组5只。

从干预第1天开始，每隔3d测量肿瘤体积（体积=长径/2×短径²），连续治疗3周后静脉注射戊巴比妥钠（15mg/kg）处死小鼠，分离肿瘤组织并称重，用于后续检测。本研究获得河北医科大学第四医院医学伦理委员会批准（批号2021KY174）。

1.2.11 免疫组织化学检测肿瘤组织中SOX9和TRAF2阳性表达

收集各组肿瘤组织样本并固定处理，固定后的组织样本切片（厚度4μm）。将组织切片置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化后进行常规微波抗原修复、过氧化氢溶液处理切片等步骤，加入特异性SOX9和TRAF2抗体孵育24h。然后加入二抗IgG。DAB显色，苏木精复染，然后使用中性树胶封片并在显微镜下观察染色结果。

1.3 统计学分析

使用Graphpad Prism 9.5软件进行统计分析，计量资料采用x±s表示，2组比较采用Student’s t检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SW480-R细胞中Lac代谢相关蛋白表达增加，并促进巨噬细胞M2极化

结果显示，经过相同浓度5-FU处理，与SW480细胞相比，SW480-R细胞对5-FU敏感性显著降低，迁移能力明显增强（均P < 0.05），见图 1A~1C。进一步对Lac相关蛋白LDHA和LAMP2检测发现，SW480-R细胞中LDHA和LAMP2表达均较SW480细胞显著增加（均P < 0.05），见图 1D。

此外，从SW480和SW480-R细胞中分离CM并干预M0巨噬细胞，结果显示，SW480-R-CM组细胞上清液中TGF-β和Arg1水平明显高于SW480-CM组（均P < 0.05），见图 1E。

2.2 Lac促进巨噬细胞M2极化并增强SW480-R细胞耐药

不同浓度Lac干预M0巨噬细胞后，细胞上清液中TGF-β和Arg1水平明显升高，其中20 mmol/L Lac效果最为显著（均P < 0.05，图 2A）。0、20 mmol/L Lac处理M0巨噬细胞，并收集CM（0 mmol/L Lac-CM、20 mmol/L Lac-CM）干预SW480和SW480-R细胞。结果发现，Lac处理能够增强SW480与SW480-R细胞活力与迁移能力，这些效应在SW480-R细胞中更加显著（均P < 0.05，图 2B、2C）。

2.3 Lac促进巨噬细胞中SOX9蛋白表达

GEPIA数据库预测结果显示，与癌旁正常组织比较，结肠癌组织中SOX9蛋白高表达（P < 0.05，图 3A）。Lac处理的M0巨噬细胞中SOX9蛋白表达检测结果显示，与0 mmol/L Lac组比较，20 mmol/L Lac组SOX9蛋白表达显著增加（P < 0.05，图 3B）。

2.4 敲减SOX9抑制Lac对SW480-R细胞生物学行为的影响

与0 mmol/L Lac组相比，20 mmol/L Lac干预M0巨噬细胞后TGF-β和Arg1水平升高，然而敲减SOX9后TGF-β和Arg1水平降低（均P < 0.05，图 4A）。进一步分离各组样品CM（0 mmol/L Lac-CM、20 mmol/L Lac-CM、20 mmol/L Lac+si-SOX9-CM）干预SW480-R细胞，检测细胞生物学行为。结果表明，与0 mmol/L Lac-CM组比较，20 mmol/L Lac-CM组SW480-R细胞活力与迁移能力增加；敲减SOX9后细胞活力与迁移能力明显抑制（均P < 0.05，图 4B、4C）。

2.5 SOX9表达影响TRAF2泛素化

Ubibrowser网站预测结果显示，SOX9可能与TRAF2泛素化存在关联（图 5A）。GEPIA数据库显示，SOX9和TRAF2在结肠癌中表达呈正相关（图 5B）。Western blotting结果显示，与0 mmol/L Lac组比较，20 mmol/L Lac组TRAF2表达显著增加（P < 0.01；图 5C）。His pull-down结果显示，与加入了TRAF2和His-Ubi抗体的M0巨噬细胞比较，加入了TRAF2、HisUbi以及SOX9抗体后M0巨噬细胞中TRAF2泛素化水平降低（图 5D）。进一步Western blotting结果显示，与0 mmol/L Lac-CM组、20 mmol/L Lac-CM组TRAF2蛋白表达增加，敲减SOX9则TRAF2蛋白表达显著降低（均P < 0.05，图 5E）。

2.6 Lac抑制5-FU的抗肿瘤作用

结果显示，与对照组相比，5-FU组小鼠成瘤体积较小、重量较轻；肿瘤组织中TGF-β和Arg1水平降低。与5-FU组相比，5-FU+Lac组小鼠成瘤体积与重量增加；TGF-β和Arg1水平升高（均P < 0.05，图 6A、6B）。免疫组织化学检测结果显示，与对照组相比，5-FU组小鼠SOX9与TRAF2阳性表达明显减少；而Lac干预后SOX9与TRAF2阳性表达显著增加（图 6C）。

3 讨论

目前，结肠癌的主要治疗策略包括手术、化疗、辅助放疗以及免疫治疗等。然而，由于缺乏针对肿瘤的高效靶向药物，化疗的耐药性使结肠癌患者死亡率居高不下^[7-8]。已有研究^[9]显示，癌细胞的耐药性对结肠癌的进展具有显著影响，不仅削弱了化疗药物的治疗效果，还促进了疾病的恶化。本研究结果显示，肿瘤来源的Lac可能通过促进巨噬细胞M2极化，并激活SOX9-TRAF2信号通路，从而加剧了结肠癌的化疗耐药性。

以往研究^[10]已证实，Lac累积源于细胞的恶性转化和代谢重编程，特别是有氧糖酵解的增强，这种代谢变化不仅促进了肿瘤细胞的增殖，还显著增强了其对化疗药物的耐药性。关于结肠癌的研究^[11]也表明，通过调控糖酵解过程和Lac生成，山柰酚能有效逆转结肠癌细胞对5-FU的耐药性，进而提升化疗效果。此外，巨噬细胞极化能够调节肿瘤的免疫微环境，从而影响肿瘤的发展和化疗耐药性，在结直肠癌耐药性中发挥关键作用^[12]。在TAMs中，Lac通过AKT/ERK信号通路诱导M2极化，并进一步分泌CCL8，在结直肠癌的发展过程中发挥调节作用^[13]。本研究结果显示，SW480-R细胞通过降低化疗敏感性、增强迁移能力和减少凋亡等方式展现出耐药性。同时，Lac产生增加以及Lac相关蛋白表达增加可能影响了巨噬细胞极化，进而促进了肿瘤的生长和耐药性。进一步使用Lac干预的M0巨噬细胞CM处理SW480-R细胞，结果证实了Lac对结肠癌耐药性的促进作用。

SOX9作为一种干细胞相关因子，在顺铂耐药的头颈部鳞状细胞癌细胞中表达水平上升；进一步功能实验提示，通过调节SOX9表达或功能，可能有效抑制癌症干细胞的活性，进而克服癌症的耐药性^[14]。在结肠癌领域，SOX9亦扮演关键角色，通过参与代谢重编程及与其他分子的相互作用，推动结肠癌的进展与恶化^[15]。作为CS3亚型的特异性标志物，SOX9与结直肠癌的预后和耐药性密切相关^[16]。在胃癌中，SOX9与巨噬细胞极化、有氧糖酵解及Lac生成紧密相连，SOX9的激活可促进巨噬细胞M2极化与有氧糖酵解过程，加速胃癌进展与转移^[17-18]。以往研究^[19]发现调控SOX9表达能够影响巨噬细胞极化。本研究结果进一步证实，Lac通过促进巨噬细胞中SOX9表达，可能诱导巨噬细胞M2极化，最终增强结肠癌细胞的耐药性和侵袭性。因此，通过抑制SOX9表达或阻断Lac/SOX9/巨噬细胞极化通路，可能有助于逆转结肠癌的耐药性，提高治疗效果。

TRAF2在癌症中的作用复杂、多变，其致癌或肿瘤抑制活性取决于癌症类型、微环境及其在信号通路中的具体作用。实体瘤中TRAF2可能通过与其他癌基因的相互作用来促进肿瘤的生长和进展^[20]；尤其在结肠癌中，TRAF2通过促进Wnt/β-连环蛋白信号传导充当癌基因的角色^[21]。有关病毒感染的研究^[6]表明，SOX9能够靶向MAVS，抑制MAVS与TRAF2结合，进而可能影响MAVS介导的TRAF2泛素化过程，调控抗病毒信号转导。本研究发现SOX9可能通过调控TRAF2泛素化状态来影响其功能和表达。同时，Lac也可能通过SOX9来调控TRAF2表达和泛素化。推测SOX9可能通过调控MAVS的表达影响MAVS-TRAF2复合体形成，进而改变TRAF2的泛素化状态；Lac通过SOX9调控TRAF2的泛素化，从而影响肿瘤的进展和耐药性。

综上所述，Lac能够增强TAMs中SOX9和TRAF2表达，进而促进结肠癌细胞的化疗耐药性，其作用机制可能是通过激活TAMs中的SOX9-TRAF2信号通路来完成的。本研究为开发新的治疗方法提供了潜在的干预策略：（1）开发特异性阻断SOX9与TRAF2结合的多肽或小分子化合物，可能有效破坏其功能复合体；（2）针对Lac生成的关键酶使用抑制剂，可减少肿瘤微环境中Lac的积累，从而抑制SOX9表达和巨噬细胞极化；（3）通过去泛素化酶抑制剂选择性增强TRAF2的泛素化降解，逆转化疗耐药性。然而，当前研究主要聚焦于Lac对TAMs的影响，而Lac与结肠癌细胞的直接作用关系仍需进一步论证。