目前，创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是导致创伤患者神经功能障碍和死亡的主要原因^[1]。TBI引起神经损伤主要包括原发性损伤和继发性损伤2种类型。原发性损伤一般由爆炸、汽车事故，高处坠落和其他坠落等引起，很少有干预措施可用于原发性损伤^[2]。继发性损伤是在原发性损伤的基础上更为复杂和长期的过程，其主要病理机制包括氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，最终导致神经元功能障碍和死亡^[3]。TBI可引起长期或短期的并发症，造成巨大的经济压力和社会负担。研究^[4]表明，氧化应激是TBI后发生继发性损伤的关键因素。因此，探索氧化应激的潜在机制和TBI后的炎症反应，明确神经保护的目标尤为重要。

Ghrelin是一种具有28个氨基酸肽的脑肠激素，在中枢神经系统中发挥多种功能，包括能量稳态、神经保护、学习和记忆、镇痛和抗畏光作用^[5-6]。此外，还有研究^[7]表明Ghrelin具有抗炎和抗细胞凋亡作用。Ghrelin静脉给药后可通过血脑屏障，并在TBI后通过减少神经元细胞凋亡发挥保护作用；Ghrelin还通过降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和增加谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平，表现出抗氧化特性^[8]。本研究探讨Ghrelin对大鼠TBI的干预效果及其作用机制，为TBI的治疗提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

Ghrelin购自美国Linco Research公司；脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；腺病毒（敲减对照）、敲减HMOX1腺病毒购自苏州吉玛基因股份有限公司；HE染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；MDA、SOD和GSH-Px酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）试剂盒，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，RIPA裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒和超敏ECL化学发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Bcl-2、Bax、β-catenin、caspase-3、caspase-9、Mfn1/2、核呼吸因子1（nuclear respiration factor 1，NRF1）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）和GAPDH抗体购自美国abcam公司；山羊抗兔二抗和荧光二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 实验动物来源及分组

SPF级雄性SD大鼠50只，体重300~350 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（辽）2021-0001。大鼠饲养于内蒙古医科大学实验动物中心，自由饮食饮水，室内温度22~24 ℃，相对湿度50%~60%，光照/光暗10 h/14 h。随机分为假手术（sham）组、TBI组和Ghrelin干预（Ghrelin）组，每组10只。20只Ghrelin干预的TBI大鼠分为Ghrelin+sh-NC组和Ghrelin+sh-HMOX1组，每组10只。

1.3 实验动物处理

大鼠造模前禁食8 h，自由饮水。大鼠用1%戊巴比妥钠（0.45 mL/kg）腹腔注射麻醉后保留自主呼吸并采用俯卧位，使用脑立体定位仪固定大鼠，TBI组和Ghrelin组均采用Feeney自由落体撞击法建立TBI模型；sham组大鼠只进行颅骨钻孔，不进行撞击。TBI模型建立主要步骤：大鼠右侧颅顶旁正中切口（长约3 mm），分离皮肤，剥离骨膜，暴露前囟、冠状缝、矢状缝和顶骨。以前囟后1.5 mm处为中心钻孔，蚊式钳扩大骨窗至4 mm，将中心粘有圆柱体（直径3 mm，高4 mm）的硬塑料板（直径1 cm，高5 cm）轻置于顶叶，其中心圆柱体置于骨窗部硬脑膜表面，随后将自由落体装置玻璃管贴紧硬塑料板上方，于垂直上方50 cm高度，将20 g砝码自玻璃管内自由落下撞击塑料板，致伤后棉球轻压止血，然后缝合头皮。Ghrelin组在大鼠造模后30 min经尾静注射Ghrelin（20 μg/kg）。Ghrelin+sh-NC组和Ghrelin+sh-HMOX1组大鼠在Ghrelin（20 μg/kg）干预的同时经尾静脉注射敲减对照（腺病毒2.5×10⁹ pfu）或敲减HMOX1腺病毒（2.5×10⁹ pfu）。本研究已获得医院医学伦理委员会批准[SC-07/01KT2023092]。

1.4 实验方法

1.4.1 HE染色造

模后72 h取大鼠脑组织，置于4%多聚甲醛固定，经脱水、浸蜡和包埋后切成石蜡切片（厚5 μm）。按照HE染色试剂盒说明书进行染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.4.2 脑水肿测量

分别测量各组大鼠新鲜脑组织（湿重）和完全干燥的脑组织（干重），用脑含水量来表示大鼠脑水肿程度。脑含水量（%）=（湿重−干重）/湿重×100。

1.4.3 ELISA

取各组大鼠脑组织，剪碎并加入PBS，组织匀浆后离心并收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测组织匀浆中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.4.4 TUNEL实验

造模后72 h取大鼠脑组织，常规石蜡包埋后切片（厚4 μm）。使用TUNEL检测试剂盒检测凋亡细胞，操作按照试剂盒说明书进行。首先，石蜡切片在水中脱蜡后与蛋白酶K工作溶液一起孵育进行修复。然后将切片用透化溶液孵育来透化细胞膜，使用TUNEL染色试剂盒的试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）的混合物37 ℃孵育切片30 min。最后使用DAPI进行细胞核复染，并用抗荧光淬灭剂固定切片，使用荧光显微镜观察切片并拍照。

1.4.5 Western blotting

将大鼠脑组织剪碎后，加入RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、Mfn1/2、NRF1、TFAM、HO-1、PGC-1α和GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL法发光。采用ImageJ软件分析电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，采用目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.4.6 免疫荧光检测线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）水平

取大鼠脑组织石蜡切片，用4%多聚甲醛固定30~60 min，PBS洗涤1次。然后加入含0.1% Trition X-100的PBS，冰浴孵育2 min，PBS洗涤2次。滴加DCFH-DA探针，37 ℃避光孵育20 min，PBS洗涤2次。用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察。

1.5 统计学分析

使用GraphPad Prism（9.3.0）软件进行数据分析，计量资料采用x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和Tukey检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果  2.1 Ghrelin对TBI大鼠脑组织具有保护作用

HE染色结果显示，与sham组相比，TBI组大鼠脑组织部分细胞发生破裂，细胞排列较为紊乱。与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑组织病理变化改善，提示Ghrelin对脑损伤有保护作用。见图 1。

2.2 Ghrelin可改善TBI大鼠脑水肿

sham组、TBI组、Ghrelin组脑含水量分别为（74.01±1.53）%、（85.35±1.50）%、（77.84±1.51）%。与sham组相比，TBI组大鼠出现明显脑水肿（P < 0.05）；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑水肿情况减轻（P < 0.05），提示Ghrelin可改善损伤引起的脑水肿。

2.3 Ghrelin对TBI大鼠脑组织氧化应激因子水平的影响

如图 2所示，与sham组相比，TBI组SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高（均P < 0.05）；与TBI组相比，Ghrelin组SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低（均P < 0.05），提示Ghrelin具有抗氧化作用。

2.4 Ghrelin对TBI大鼠脑神经元凋亡的影响

TUNEL染色结果如图 3所示，与sham组相比，TBI组大鼠脑神经元凋亡显著增加；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑神经元凋亡显著降低。

2.5 Ghrelin对TBI大鼠脑组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果如图 4所示，与sham组相比，TBI组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平升高（均P < 0.05）；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平降低（均P < 0.05），提示Ghrelin降低脑组织细胞的凋亡。

2.6 Ghrelin对TBI大鼠脑组织mtROS水平的影响

免疫荧光检测结果如图 5所示，与sham组相比，TBI组大鼠脑组织mtROS水平升高；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑组织mtROS水平降低，提示Ghrelin具有抗氧化作用。

2.7 Ghrelin对TBI大鼠线粒体功能相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果如图 6所示，与sham组相比，TBI组大鼠脑组织Mfn1/2、NRF1和TFAM蛋白表达水平降低（均P < 0.05）；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑组织Mfn1/2、NRF1和TFAM蛋白表达水平升高（均P < 0.05），提示Ghrelin对线粒体功能具有保护作用。

2.8 Ghrelin对TBI大鼠脑组织HO-1/PGC-1α信号通路蛋白表达的影响

Western blotting检测结果如图 7所示，与sham组相比，TBI组大鼠脑组织HO-1、PGC-1α蛋白表达水平升高（均P < 0.05）；与TBI组相比，Ghrelin组大鼠脑组织HO-1、PGC-1α蛋白表达水平升高（均P < 0.05）。

2.9 敲减HMOX1对Ghrelin处理的TBI大鼠脑组织凋亡相关蛋白和氧化应激因子表达的影响

Western blotting检测结果如图 8所示，与Ghrelin+sh-NC组相比，Ghrelin+sh-HMOX1组大鼠脑组织HO-1、PGC-1α和Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平升高（均P < 0.05）。提示敲减HMOX1逆转了Ghrelin诱导的HO-1/PGC-1α信号通路激活，并逆转其对脑组织细胞凋亡的抑制作用。

ELISA检测结果如图 9所示，与Ghrelin+sh-NC组相比，Ghrelin+sh-HMOX1组大鼠脑组织SOD、GSH-Px水平降低，MDA水平升高（均P < 0.05），提示敲减HMOX1逆转了Ghrelin的抗氧化作用。

3 讨论

TBI通过一系列神经化学和信号变化引起神经功能障碍，发病率和死亡率均较高，是目前较为棘手的问题之一^[9]。目前尚无减轻TBI的有效方法，且TBI诱导神经变性的分子机制仍然不清楚。已有研究^[8]发现Ghrelin对TBI具有改善作用，Ghrelin可增加TBI大鼠血清GSH、CAT和GSH-Px以及脑组织中GSH和CAT水平，降低血清MDA和IL-1β以及脑组织中MDA、TGF-β1和IL-8水平，抑制脑组织中炎症反应，改善神经元和血管损伤，降低脑组织中GFAP表达^[8]。Ghrelin是生长激素促分泌素受体1α（growth hormone secretagogue receptor 1α，GHSR-1α）的独特内源性配体，在大脑中发挥抗凋亡作用^[10]。本研究结果显示，Ghrelin可减轻TBI大鼠神经元凋亡。此外，本研究还发现Ghrelin可降低TBI大鼠脑组织中Bax、caspase-3和caspase-9蛋白表达，进一步证明了其对TBI诱导的神经元凋亡的改善作用。

TBI后的继发性脑损伤是涉及氧化应激、钙离子稳态丧失、炎症反应和其他因素的连锁反应^[11-12]。氧化应激是TBI病理生理的关键因素之一，可诱导神经功能缺损^[13-14]。ROS可诱导脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤；在TBI中，升高的ROS发挥着重要作用^[4]。MDA水平在TBI后立即升高，且可反映脂质过氧化水平。同时，细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px清除自由基产生的代谢产物，并将脂质过氧化物和过氧化氢转化为无毒化合物。本研究发现Ghrelin干预可降低TBI大鼠脑组织中MDA水平，增加SOD和GSH-Px活性，与以往研究^[8]结果一致。此外，本研究还发现Ghrelin干预可降低TBI大鼠脑组织中mtROS水平，并上调Mfn1/2、NRF1和TFAM蛋白表达水平。Mfn1/2参与线粒体融合过程，而NRF1和TFAM在线粒体生物发生中发挥关键作用^[15]。这些结果表明Ghrelin对TBI诱导的脑组织中氧化应激的抑制作用可能与改善线粒体功能有关。

越来越多的证据^[16-17]表明，激活HO-1/PGC-1α信号通路具有神经保护性抗炎和抗氧化作用。本研究发现Ghrelin可显著增加TBI大鼠脑组织中HO-1和PGC-1α蛋白表达。此外，本研究还发现HO-1的编码基因HMOX1敲减后，Ghrelin干预的TBI大鼠脑组织中Bax、caspase-3、caspase-9表达以及MDA、GSH-Px水平升高，SOD水平降低（均P < 0.05），表明敲减HMOX1逆转了Ghrelin对TBI大鼠脑组织中细胞凋亡的抑制以及抗氧化作用。

综上所述，Ghrelin干预可改善TBI大鼠脑损伤，通过上调HO-1表达改善TBI大鼠脑组织细胞凋亡和氧化应激，其机制可能与诱导HO-1/PGC-1α信号通路激活有关。然而，本研究仅检测了敲减HMOX1对Ghrelin干预的TBI大鼠脑组织凋亡相关蛋白和氧化应激因子表达的影响，Ghrelin是否介导HMOX1影响TBI诱导的脑损伤仍有待进一步验证。