N-甲基小檗胺（N-methyl berbamine，N-MB）是一种从小檗属植物细叶小檗根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，结构与小檗胺相似^[1]。小檗胺具有免疫调节、抗肿瘤、抗心律失常以及抗心肌缺血缺氧等作用^[2]。根据构效关系推测，小檗胺的N-甲基类似物也应有相似的药理作用。有研究^{[1, 3]}表明，N-MB对心血管系统具有一定的保护作用，如抗心律失常、保护心肌缺血再灌注损伤、降低血压等，然而其确切机制尚未完全阐明。

Ca²⁺参与机体的许多生物学过程，包括肌肉收缩和心脏电活动。心肌细胞内Ca²⁺释放和再吸收会导致心肌细胞收缩和舒张。钙稳态可以调控心肌细胞的收缩和舒张，从而维持心脏的正常节律和有效泵血功能。在心肌细胞中，钙稳态受到多种蛋白调控，主要包括L型电压依赖钙通道（L-type calcium channel，LTCC）、肌浆网Ca²⁺-ATP酶2a、受磷蛋白、Na⁺/Ca²⁺交换体、Ryanodine受体、质膜钙泵蛋白、线粒体Ca²⁺单向转运蛋白及钙调蛋白等^[4-5]。在心肌细胞中，膜去极化导致Ca²⁺通过位于横（T）小管的LTCC快速流入细胞，流入的Ca²⁺触发肌浆网内储存的Ca²⁺通过Ryanodine受体大量释放，激活心肌细胞的收缩机制^[5-7]。在心肌细胞舒张期，主要通过2个途径降低细胞内的Ca²⁺浓度，即Na⁺/Ca²⁺交换体和肌浆网/内质网Ca²⁺-ATP酶。前者将细胞内的Ca²⁺与细胞外的Na⁺交换，将Ca²⁺泵出细胞，后者可将Ca²⁺从细胞质中泵入肌浆网，储存以供下一次收缩使用^[8-9]。L型钙通道功能异常或者Ca²⁺发生紊乱，将会导致心脏收缩功能障碍以及心律失常^[10]。有研究^[11]发现，细胞内Ca²⁺调控紊乱还参与心房颤动的病程发展，是心力衰竭的重要发病机制。本研究探讨N-MB对心肌细胞内钙稳态的调节作用，从而明确其对心肌保护作用的可能机制。

1 材料与方法 1.1 材料

N-MB购自中国科学院沈阳应用生态研究所。DMEM高糖培养基、L-glutamine、G418、hygromycin B、zeocin和trypsin-EDTA购自美国Invitrogen公司。胎牛血清购自德国SeraPro公司。DMSO购自加拿大Biosharp公司。NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、NaHCO₃及MgSO₄·7H₂O购自北京化学工业集团有限责任公司。青/链霉素双抗购自美国Gibco公司。HEPES、TEA-Cl、葡萄糖、MgATP及CsOH购自美国Sigma公司。KH₂PO₄购自辽宁药业医药经贸有限公司。Fluo 3-AM试剂盒购自日本Dojindo公司。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。

1.2 N-MB与Ca_V1.2通道模拟对接

通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获得N-MB的结构，通过PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）获得Ca_V1.2通道的氨基酸序列，蛋白质数据库（protein data bank，PDB；http://www.wwpdb.org）获取Ca_V1.2通道的三维结构。利用MOE（2019.0102）软件将分子量较大的Ca_V1.2通道作为受体、分子量较小的N-MB作为配体进行对接。对Ca_V1.2通道蛋白的三维结构进行去水、加氢等预处理，运用Site Finder寻找Ca_V1.2通道蛋白的活性口袋，然后通过Docking程序模拟二者的结合，通过结果评分判断二者的结合能力和结合模式。

1.3 细胞培养与处理

1.3.1 HEK293细胞

稳定表达hCa_V1.2的HEK293细胞培养于直径35 mm的细胞培养皿中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱培养，每48 h按1∶4比例进行传代。培养基配方为90% DMEM、10% 胎牛血清、2 mmol/L L-glutamine、100 μg/mL G418、100 μg/mL hygromycin B和40 μg/mL zeocin。实验当天吸去细胞培养上清液，用PBS冲洗后，加入0.25% trypsin-EDTA溶液，室温下消化3~5 min。弃掉消化液，用细胞外液重悬后将细胞转移至用于电生理记录的实验皿中备用。

1.3.2 H9c2细胞

H9c2细胞培养于t25细胞培养瓶中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱培养。培养基配方为90% DMEM、10%胎牛血清、1%青/链霉素双抗。N-MB用无血清的DMEM培养液稀释至工作浓度（3、30 μmol/L），药物处理细胞24 h后进行检测，同时设置不含药物的培养基作为对照组。

1.4 膜片钳电生理实验

取稳定表达hCa_V1.2通道的HEK293细胞，室温下用全细胞膜片钳技术记录Ca_V1.2通道电流。细胞外液组成：120 mmol/L NaCl，10 mmol/L BaCl₂，10 mmol/L HEPES，20 mmol/L TEA-Cl，10 mmol/L葡萄糖，用NaOH调节pH至7.4。玻璃微电极由玻璃电极毛胚（BF150-86-10，Sutter）经拉制仪拉制而成，灌注电极内液（130 mmol/L CsCl，5 mmol/L MgATP，130 mmol/L CsCl，5 mmol/L MgATP，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L TEA-Cl，10 mmol/L HEPES，用CsOH调节pH至7.2），其后电极尖端电阻为2~5 MΩ。将玻璃微电极插入放大器探头连接至膜片钳放大器，钳制电压和数据记录由pClamp 10软件通过电脑控制和记录，采样频率为10 kHz，滤波频率为2 kHz。在进入全细胞记录模式后，细胞钳制在-80 mV，诱发Ca_V1.2电流的步阶电压从-80 mV给予1个100 ms的去极化电压到0 mV，再返至-80 mV。每10 s给予此电压刺激，确定电流稳定后（1 min）开始给药过程，每次给药持续时间≥1 min。

1.5 细胞内Ca²⁺测定

N-MB给药24 h后弃去培养液，用1× HBSS洗涤细胞3次，然后加入200 μL的5 μmmol/L的Fluo 3-AM工作液，37 ℃孵育30 min；再用HBSS洗涤3次后加入1 mL HBSS覆盖住细胞，37 ℃孵育30 min；将细胞转移至激光共聚焦显微镜上观测细胞内Ca²⁺荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.6 实时定量PCR检测

按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取细胞的总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书在标准条件下（37 ℃15 min，85 ℃4 s，4 ℃）合成cDNA，总反应体积为20 μL。合成适合实时定量PCR反应的Cacna1c、Cacnb2、Ryr2、Serca2a、Ncx1和内参GAPDH的特异性引物，引物序列见表 1。将反转录得到的cDNA应用SYBR Green Premix Ex TaqⅡ在Applied Biosystems 7500实时定量PCR系统中进行反应。反应条件如下：起始退火温度95 ℃，进行30 s；然后按照95 ℃5 s，60 ℃34 s，共扩增40个循环。实验结束后检测其融解曲线并保证其仅含有单峰。根据2^-ΔΔCt法计算获得基因的相对表达量。

1.7 统计学分析

利用SPSS 29.0软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），事后检验采用Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 N-MB和Ca_V1.2通道的结合预测

通过MOE模拟对接实验，发现N-MB和Ca_V1.2通道可以结合（图 1A），主要结合位点涉及Phe1191、Thr1420、Asn771、Glu340、Asp342和Asp341（图 1B），结果评分均为负值，说明二者间相互作用是自发且稳定的，相互作用的方式有H-donor、pi-pi、pi-H 3种，见表 2。

2.2 N-MB对Ca_V1.2通道电流的影响

全细胞膜片钳实验结果显示，30 μmol/L N-MB对转染hCa_V1.2的HEK293细胞的Ca_V1.2钙通道电流产生明显抑制作用。与对照组相比，加入30 μmol/L N-MB处理后，钙电流的峰值从（-24.79±7.27）pA/pF减少至（-5.67±1.72）pA/pF，抑制率为（76.09±7.41）%，差异有统计学意义（P<0.05），见图 2。提示N-MB可抑制Ca_V1.2钙通道，参与调节细胞内钙稳态。

2.3 N-MB对H9c2心肌细胞内Ca²⁺浓度的影响

为了进一步明确N-MB对细胞内Ca²⁺的调节作用，采用Fluo-3AM荧光标记结合激光共聚焦法测定N-MB对H9c2心肌细胞内Ca²⁺浓度的影响。结果显示，对照组、3 μmol/L N-MB组、30 μmol/L N-MB组细胞内荧光强度分别为1.84±0.51、4.68±0.51、3.19±0.57。与对照组相比，3 μmol/L N-MB组、30 μmol/L N-MB组细胞内荧光强度显著增加（均P<0.01），表明3 μmol/L、30 μmol/L N-MB均可升高心肌细胞内Ca²⁺浓度（图 3）。

2.4 Ca²⁺调控相关基因表达的变化

实时定量PCR检测N-MB对Ca²⁺调控相关基因Cacna1c、Cacnb2、Ryr2、Serca2a、Ncx1表达的影响。结果显示，与对照组相比，N-MB干预后，Cacna1c、Serca2a、Ncx1表达水平差异均无统计学意义（均P>0.05），而Cacnb2表达水平明显下降（P<0.001），Ryr2表达水平明显升高（P<0.05），见表 3。

3 讨论

Ca²⁺是细胞内重要的第二信使，可以通过控制和触发包括膜稳定、收缩、分泌、细胞间通信、激活激酶等多种机制来调节细胞功能^[5]。人体通过吸收、储存和排泄的生理过程维持Ca²⁺浓度在正常范围内。细胞内钙稳态可以维持骨骼健康，参与信号转导，调节肌肉收缩，促进血液凝固^[12]。在心肌细胞内，Ca²⁺经多种蛋白调控来维持稳态。生理条件下，膜电位的去极化和复极化，触发兴奋收缩偶联（excitation-contraction coupling，ECC）。Ca²⁺经由LTCC内流，激活Ryanodine受体，促进Ca²⁺从肌浆网释放，释放的Ca²⁺与肌钙蛋白结合，通过肌动蛋白-肌球蛋白丝桥形成引起收缩^[5-6]。然而，在病理条件下，例如钙超负荷诱导细胞凋亡，会导致心肌梗死和心律失常；钙瞬时振幅降低和肌浆网钙渗漏增强，会导致心力衰竭^[13]。因此，维持钙稳态的平衡至关重要。

N-MB为细叶小檗中的天然产物，现有研究^[14-16]表明N-MB具有抗心肌缺血、抗心律失常、扩血管的作用，但其具体机制仍不明确。推测N-MB可能作用于钙通道，影响钙通道的功能，进而调节钙稳态。本研究通过MOE软件预测获得N-MB与Ca_V1.2钙通道三维结合模型与结合位点信息，证实了二者的直接结合作用。为进一步研究N-MB对细胞内钙稳态调节的影响，通过膜片钳电生理实验发现N-MB可对Ca_V1.2钙通道电流产生抑制作用。同时，实时定量PCR检测结果显示，参与编码L型钙通道β2亚基的Cacnb2在N-MB干预后表达显著减少，而参与编码Ryanodine受体的Ryr2在N-MB干预后表达显著增加。之前有研究^[17]证明Cacnb2突变和表达水平下调均会影响钙通道的功能。因此推测N-MB可导致Cacnb2表达降低，Ca_v1.2钙通道一定程度上被抑制。激光共聚焦显微镜测定结果显示，N-MB可升高心肌细胞内Ca²⁺浓度；结合PCR结果，认为Ryr2表达水平上升增加了Ryr2亚基的开放概率，进而增加了细胞内Ca²⁺浓度。虽然电生理实验结果显示N-MB可以抑制Ca_V1.2钙通道，可能导致通过Ca_V1.2钙通道进入细胞的Ca²⁺在一定程度上减少，但结合细胞内Ca²⁺荧光强度的变化，发现N-MB可以升高细胞内Ca²⁺浓度。FOWLER等^[18]发现，激活Ryanodine受体所需的Ca²⁺很少。因此，推测Ca²⁺从肌浆网释放的过程并没有被打断，反而由于某种代偿机制，Ryr2的表达增加，细胞内Ca²⁺增加，维持了细胞内的钙稳态。同时，结果显示N-MB对参与编码Na⁺/Ca²⁺交换体的Ncx1与参与编码肌浆网Ca²⁺-ATP酶2a的Serca2a表达无显著影响。

综上所述，N-MB可以与Ca_V1.2钙通道结合。N-MB参与细胞内钙稳态的调节，发挥心肌保护作用；其作用机制可能是通过抑制Ca_V1.2钙通道的表达抑制钙电流，同时促进Ryr2的表达，从而升高细胞内Ca²⁺浓度来实现的。本研究为探寻天然药物来源的心血管保护药物奠定了一定的基础。本研究仅检测了Ca²⁺调节相关基因表达，具有一定的局限性，后续需进一步探讨相关蛋白的表达，从而为明确N-MB心肌保护机制提供更多依据。