2025, Vol. 54文章信息
- 方虹, 鲁林
- FANG Hong, LU Lin
- miR-200c-3p靶向调控Notch1表达对异位子宫内膜间质细胞增殖、凋亡和迁移的影响
- Effect of miR-200c-3p on the proliferation, apoptosis, and migration of ectopic endometrial stromal cells through targeted regulation of the Notch1 expression
- 中国医科大学学报, 2025, 54(12): 1101-1106, 1113
- Journal of China Medical University, 2025, 54(12): 1101-1106, 1113
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文章历史
- 收稿日期：2024-10-24
- 网络出版时间：2025-12-15 12:16:27
引用本文 |
2. 武汉市中医医院骨科，武汉 430000
2. Department of Orthopedics, Wuhan Traditional Chinese Medicine Hospital, Wuhan 430000, China
子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）可导致育龄女性盆腔疼痛和不孕症。研究[1]显示，异位子宫内膜间质细胞（ectopic endometrial stromal cell，EESC）的增殖、迁移和侵袭特性与恶性肿瘤细胞相似，且EMT中存在上皮-间质转化[2]。然而，EESC增殖、迁移的分子机制仍不完全清楚，因此亟需进一步探讨其分子机制并制定更加有效的治疗策略。
微RNA（microRNA，miRNA）可通过调控靶基因表达，参与细胞增殖、凋亡和迁移等生物学过程，miR-200c-3p可抑制肿瘤细胞上皮-间质转化、侵袭和血管生成[3]。研究[4]显示，EMT患者异位子宫内膜中miR-200c-3p表达降低，上调其表达可抑制子宫内膜细胞侵袭。而Notch1在EMT患者异位内膜组织中的表达高于在位内膜[5]，抑制Notch1表达可降低子宫内膜干细胞增殖和迁移[6]。TargetScan软件预测发现，miR-200c-3p与Notch1存在互补序列，且有研究[7]证实Notch1是miR-200c-3p的靶标。本研究探讨了在EESC中过表达miR-200c-3p并上调Notch1对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，旨在明确miR-200c-3p能否通过调控Notch1影响EESC恶性生物学行为。
1 材料与方法 1.1 组织来源选取2022年1月至2023年1月就诊于湖北省中医院的30例EMT患者，平均年龄（35.20±2.26）岁，从卵巢子宫内膜异位囊肿的囊壁中获取异位的子宫内膜组织；选取同期就诊于湖北省中医院的30例育龄无EMT妇女，平均年龄（36.48±2.19）岁，获取其正常子宫内膜组织。本研究获得湖北省中医院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。
1.2 主要试剂Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；兔源一抗Notch1、波形蛋白（Vimentin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）和GAPDH均购自英国abcam公司；miR-200c-3p模拟物（miR-200c-3p mimics）及其对照（miR-NC）、Notch1过表达质粒（pcDNA3.1-Notch1）及其对照（pcDNA3.1-NC）均购自广州市锐博生物科技有限公司；QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒购自美国安捷伦科技有限公司。
1.3 原代细胞培养新鲜的异位子宫内膜组织用PBS冲洗3次，并用微型剪刀切碎。然后，用Ⅱ型胶原酶（1 mg/mL）消化组织60 min，随后通过100 μm和40 μm孔径的尼龙网过滤分离EESC。分离出的EESC置于DMEM/F12培养基[内含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、100 U/mL双抗）]，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。第3次传代后使用抗Vimentin（1∶1 000）和抗E-cadherin（1∶1 000）抗体通过免疫荧光对EESC的纯度进行测定，选取纯度 > 99%的EESC进行后续实验[8]。
1.4 细胞转染将EESC以5×104/mL的密度接种到6孔板中，并在37 ℃下培养过夜。将EESC分为Control组（常规培养）、miR-NC组（转染阴性对照NC mimic）、miR-200c-3p-OE组（转染miR-200c-3p mimic）、miR-200c-3p-OE+pc-NC组（共转染miR-200c-3p mimic与pcDNA3.1空载体）、miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组（共转染miR-200c-3p mimic与pcDNA3.1-Notch1载体）。使用lipofectamine 2000转染，48 h后通过实时定量PCR评估转染效率。
1.5 实时定量PCR从正常子宫内膜组织、异位子宫内膜组织以及各组EESC中提取总RNA，并将其反转录为cDNA，使用SYBR Green Mix进行实时定量PCR。引物序列如下：miR-200c-3p，正向5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，反向5’-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3’；U6，正向5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；Notch1，正向5’-TCCAACTGCGACACCAACCC-3’，反向5’-CCCAGCGAGCACTCATCCAC-3’；GAPDH，正向5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’和反向5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’。以U6或GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。所有实验重复3次。
1.6 MTT转染48 h后，将各组EESC接种到96孔板（5×104/mL，100 μL/孔）中并在37 ℃下孵育过夜。按照MTT法进行相应操作，孵育结束后在490 nm波长下检测吸光度（absorbance，A），并评估细胞活力。
1.7 流式细胞术收集细胞，按照凋亡检测试剂盒分别添加5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI在室温下避光染色15 min。使用FACSCalibur流式细胞仪（美国碧迪医疗生物技术有限公司）分析凋亡细胞（早期+晚期凋亡细胞的百分比）。
1.8 Transwell实验转染48 h后，将各组EESC（2×104/孔，100 μL）接种到无血清DMEM的Transwell板的上室中（Transwell上室膜用Matrigel预包被30 min，仅用于侵袭试验）。将600 μL含有10% FBS的DMEM培养基接种到下室中。在37 ℃下孵育24 h后取出小室，固定、染色后洗涤，于小室晾干后用Ⅸ73荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）观察细胞迁移及侵袭情况。
1.9 Western blotting用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量。于蛋白变性后行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭。结束后，添加对应一抗[Notch1（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶5 000）和GAPDH（1∶2 500）] 于4 ℃孵育过夜，次日将膜与二抗（1∶2 000）于室温下孵育1 h，随后曝光检测。
1.10 双萤光素酶报告基因实验使用TargetScan软件（版本7.1；http://www.target-scan.org/vert_71/）预测miR-200c-3p与Notch1之间的结合序列。通过扩增含有miR-200c-3p靶序列的Notch1 3’非翻译区（untranslated region，UTR），并将其整合到pmirGLO载体中，以构建野生型（wild type，WT）-Notch1报告载体。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒构建突变型（mutant type，MUT）-Notch1报告载体。将EESC在37 ℃下孵育24 h后，用lipofectamine 2000将WT-Notch1、MUT-Notch1报告载体分别与miR-200c-3p mimics或miR-NC共转染到EESC中。48 h后检测萤光素酶活性。
1.11 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。多组比较采用单因素方差分析和SNK-q检验；组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 子宫内膜组织中miR-200c-3p和Notch1表达与正常子宫内膜组织（1.00±0.09，1.00±0.13，0.22±0.04）比较，异位子宫内膜组织miR-200c-3p表达（0.57±0.06）降低，Notch1 mRNA（2.89±0.21）和蛋白表达（0.61±0.07）升高（P < 0.05），见图 1。
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| 1, normal endometrial tissue; 2, ectopic endometrial tissue. 图 1 Western blotting检测子宫内膜组织中Notch1蛋白表达结果 Fig.1 Notch1 expression in endometrial tissue by Western blotting |
2.2 各组EESC中miR-200c-3p和Notch1的表达比较
与Control组、miR-NC组比较，miR-200c-3p-OE组miR-200c-3p表达水平升高，Notch1 mRNA和蛋白表达降低（P < 0.05）；与miR-200c-3p-OE组、miR-200c-3p-OE+pc-NC组比较，miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组Notch1 mRNA和蛋白表达升高（P < 0.05）。见图 2、表 1。
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| 1, Control group; 2, miR-NC group; 3, miR-200c-3p-OE group; 4, miR-200c-3p-OE+pc-NC group; 5, miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 group. 图 2 Western blotting各组EESC中Notch1蛋白表达 Fig.2 Notch1 expression of EESC in each group by Western blotting |
| Group | n | miR-200c-3p | Notch1 mRNA | Notch1 protein |
| Control | 6 | 1.00±0.12 | 1.01±0.10 | 0.43±0.05 |
| miR-NC | 6 | 0.98±0.10 | 1.03±0.11 | 0.44±0.06 |
| miR-200c-3p-OE | 6 | 2.75±0.191），2） | 0.42±0.071），2） | 0.18±0.031），2） |
| miR-200c-3p-OE+pc-NC | 6 | 2.81±0.16 | 0.40±0.06 | 0.17±0.03 |
| miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 | 6 | 2.79±0.17 | 0.85±0.093），4） | 0.36±0.043），4） |
| 1）P < 0.05 vs. Control group；2）P < 0.05 vs. miR-NC group；3）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE group；4）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE+pc-NC group. | ||||
2.3 各组EESC活力比较
与Control组、miR-NC组比较，miR-200c-3p-OE组细胞活力降低（P < 0.05）；与miR-200c-3p-OE组、miR-200c-3p-OE+pc-NC组比较，miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组细胞活力升高（P < 0.05）。见表 2。
| Group | n | Cell viability | Apoptosis rate（%） |
| Control | 6 | 0.81±0.10 | 3.22±0.40 |
| miR-NC | 6 | 0.84±0.09 | 3.17±0.38 |
| miR-200c-3p-OE | 6 | 0.52±0.071），2） | 19.69±0.721），2） |
| miR-200c-3p-OE+pc-NC | 6 | 0.49±0.06 | 20.03±0.75 |
| miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 | 6 | 0.73±0.083），4） | 8.81±0.563），4） |
| 1）P < 0.05 vs. Control group；2）P < 0.05 vs. miR-NC group；3）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE group；4）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE+pc-NC group. | |||
2.4 各组EESC凋亡水平比较
与Control组、miR-NC组比较，miR-200c-3p-OE组细胞凋亡率升高（P < 0.05）；与miR-200c-3p-OE组、miR-200c-3p-OE+pc-NC组比较，miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组细胞凋亡率降低（P < 0.05）。见图 3、表 2。
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| A, Control group; B, miR-NC group; C, miR-200c-3p-OE group; D, miR-200c-3p-OE+pc-NC group; E, miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 group. 图 3 各组EESC凋亡情况 Fig.3 Apoptosis status of EESC in each group |
2.5 各组EESC迁移和侵袭能力比较
与Control组、miR-NC组比较，miR-200c-3p-OE组细胞迁移和侵袭数降低（P < 0.05）；与miR-200c-3p-OE组、miR-200c-3p-OE+pc-NC组比较，miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组细胞迁移和侵袭数升高（P < 0.05）。见图 4、表 3。
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| 图 4 各组EESC迁移和侵袭情况结晶紫染色×200 Fig.4 Migration and invasion of EESC in each group Crystal violet staining×200 |
| Group | n | Cell migration number | Cell invasion number |
| Control | 6 | 125.35±15.82 | 92.80±10.75 |
| miR-NC | 6 | 128.40±16.13 | 93.36±11.20 |
| miR-200c-3p-OE | 6 | 60.26±9.271），2） | 45.42±6.941），2） |
| miR-200c-3p-OE+pc-NC | 6 | 58.93±8.89 | 42.90±7.37 |
| miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 | 6 | 101.34±13.153），4） | 80.15±9.403），4） |
| 1）P < 0.05 vs. Control group；2）P < 0.05 vs. miR-NC group；3）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE group；4）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE+pc-NC group. | |||
2.6 各组EESC上皮-间质转化相关蛋白表达比较
与Control组、miR-NC组比较，miR-200c-3p-OE组E-cadherin蛋白水平升高，Vimentin、N-cadherin蛋白水平降低（P < 0.05）；与miR-200c-3p-OE组、miR-200c-3p-OE+pc-NC组比较，miR-200c-3p-OE+pc-Notch1组E-cadherin蛋白水平降低，Vimentin、N-cadherin蛋白水平升高（P < 0.05）。见图 5、表 4。
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| 1, Control group; 2, miR-NC group; 3, miR-200c-3p-OE group; 4, miR-200c-3p-OE+pc-NC group; 5, miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 group. 图 5 各组EESC上皮-间质转化相关蛋白的Western blotting检测结果 Fig.5 Western blotting results for epithelial-mesenchymal transition-related proteins of EESC in each group |
| Group | n | Vimentin | E-cadherin | N-cadherin |
| Control | 6 | 0.55±0.07 | 0.23±0.04 | 0.79±0.09 |
| miR-NC | 6 | 0.59±0.06 | 0.20±0.03 | 0.82±0.10 |
| miR-200c-3p-OE | 6 | 0.24±0.041），2） | 0.61±0.061），2） | 0.43±0.061），2） |
| miR-200c-3p-OE+pc-NC | 6 | 0.20±0.04 | 0.63±0.07 | 0.42±0.07 |
| miR-200c-3p-OE+pc-Notch1 | 6 | 0.43±0.053），4） | 0.39±0.053），4） | 0.71±0.093），4） |
| 1）P < 0.05 vs. Control group；2）P < 0.05 vs. miR-NC group；3）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE group；4）P < 0.05 vs. miR-200c-3p-OE+pc-NC group. | ||||
2.7 miR-200c-3p与Notch1的靶向关系验证
miR-200c-3p与Notch1之间存在结合序列，见图 6。共转染miR-200c-3p mimics（0.34±0.05）较共转染miR-NCWT-Notch1（1.01±0.08）相对萤光素酶活性降低（P < 0.05）；MUT-Notch1的相对萤光素酶活性在共转染miR-NC（1.00±0.09）和miR-200c-3p mimics（0.98±0.10）的细胞中无统计学差异（P > 0.05）。
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| 图 6 TargetScan软件预测的miR-200c-3p与Notch1的结合序列 Fig.6 Binding sequence between miR-200c-3p and Notch1 predicted by TargetScan software |
3 讨论
EMT是育龄女性慢性盆腔痛、不孕症的主要原因[9]。ESC在一系列激素、生长因子、趋化因子和炎症介质的作用下表现出更强的侵袭性和迁移性。因此，积极探索ESC迁移、侵袭相关分子机制，对提高治疗有效性有重要意义。miR-200c-3p作为肿瘤抑制基因，调控多种肿瘤细胞的异常增殖、凋亡、侵袭和迁移[10]。既往研究[11]表明，miR-200c-3p在EMT患者异位子宫内膜组织中表达降低，其过表达可抑制EESC的增殖、迁移及上皮-间质转化，但其在EMT发病机制中的作用尚未完全明确。
本研究发现异位子宫内膜组织中miR-200c-3p表达低于正常子宫内膜组织，表明miR-200c-3p水平的降低参与了EMT的发病机制。miR-200c-3p mimics可抑制EESC增殖、侵袭和迁移。上皮细胞标志物E-cadherin的丢失和间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的增加能够促进细胞转移[12]。ZUBRZYCKA等[13]发现与上皮-间质转化相关的miRNA可作为EMT的新分子生物标志物。XUE等[14]的研究显示miR-223可抑制EMT中上皮-间质转化相关分子的表达，降低细胞迁移、侵袭和增殖。本研究发现miR-200c-3p mimics处理后N-cadherin和Vimentin表达降低，E-cadherin表达升高，证实miR-200c-3p可抑制EESC恶性生物学行为。
miRNA能够通过与靶mRNA的3’ UTR结合，参与EMT的发生发展[15]。本研究发现Notch1是miR-200c-3p的靶点，并受miR-200c-3p负调控。研究[5]表明EMT患者异位子宫内膜组织中Notch1表达上调。本研究发现异位子宫内膜组织中Notch1表达较高；且EESC中miR-200c-3p的过表达导致Notch1的mRNA和蛋白表达降低。为确定miR-200c-3p是否通过直接靶向Notch1影响EESC增殖、迁移和侵袭，本研究在EESC中过表达miR-200c-3p和Notch1，结果发现，Notch1表达升高可逆转miR-200c-3p-OE对EESC恶性生物学行为的抑制作用。LUO等[16]认为miR-34c-5p可通过靶向抑制Notch1表达，促进E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达，抑制EMT中上皮-间质转化过程以及细胞侵袭和迁移；这进一步为miR-200c-3p通过靶向Notch1抑制EMT进展提供了可能的证据。
综上所述，本研究首次提出miR-200c-3p可能通过靶向抑制Notch1表达抑制EESC恶性生物学行为，可为EMT的治疗提供新方向。然而，后续还需要扩大样本量，纳入体内实验做进一步探讨。
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