2025, Vol. 54文章信息
- 徐芳丽, 王焕, 徐可
- XU Fangli, WANG Huan, XU Ke
- miR-488-3p调控cGAS-STING信号通路对肾小管上皮细胞损伤的影响
- Effects of miR-488-3p on renal tubular epithelial cell injury by regulating the cGAS-STING signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2025, 54(11): 982-987
- Journal of China Medical University, 2025, 54(11): 982-987
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文章历史
- 收稿日期：2024-10-10
- 网络出版时间：2025-11-21 13:04:26
引用本文 |
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种常见的临床综合征，在全球住院患者中的发生率约为19.3%~31%[1]。目前AKI的发病机制尚未明确，治疗手段有限。肾小管上皮细胞损伤是AKI中最重要的事件[2]。因此，探讨肾小管上皮细胞损伤的潜在机制对确定AKI的治疗靶点具有重要意义。研究[3]表明，微RNA（micro RNA，miRNA）表达异常与肾小管上皮细胞损伤有关，如miR-488-3p可诱导小鼠肾小球足细胞凋亡[4]。研究[5]发现，抑制环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）通路可缓解小鼠AKI，因此，本研究拟探讨miR-488-3p调控cGAS-STING通路对肾小管上皮细胞损伤的影响及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人肾小管上皮细胞系HK-2购自上海普诺赛生物工程有限公司。
1.1.2 试剂miR-488-3p抑制剂及其抑制剂对照（inhibitor NC）、cGAS-STING通路激活剂RocA（美国MCE公司）；CCK-8试剂盒（济南远达晶美生物科技有限公司）；人白细胞介素（interleukin，IL）-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）；DCFH-DA（上海抚生实业有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（广州美仑生物科技有限公司）；cleaved caspase-3、Bcl-2关联X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、GAPDH、cGAS、STING一抗及二抗（英国abcam公司）。
1.2 方法 1.2.1 细胞分组将HK-2细胞分为对照组、HR组、抑制对照组、miR-488-3p抑制组、RocA组、miR-488-3p抑制+RocA组。对照组HK-2细胞正常培养；HR组HK-2细胞进行缺氧（1%O2+94%N2+5%CO2）处理4 h后再进行复氧（5%CO2+95%O2）处理2 h[6]；抑制对照组HK-2细胞转染inhibitor NC 24 h后，缺氧处理4 h，复氧处理2 h；miR-488-3p抑制组HK-2细胞转染miR-488-3p抑制剂24 h后，缺氧处理4 h，复氧处理2 h；RocA组HK-2细胞用25 nmol/L RocA处理24 h后，缺氧处理4 h，复氧处理2 h[7]；miR-488-3p抑制+RocA组HK-2细胞转染miR-488-3p抑制剂的同时，还用25 nmol/L RocA处理24 h，再进行缺氧处理4 h，复氧处理2 h。处理结束后收集各组细胞。
1.2.2 miR-488-3p表达水平检测收集各组细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，用NanoDrop 2000测定RNA浓度，将RNA逆转录为cDNA后，采用ABI7500系统进行实时定量PCR。以U6作内参照，采用2-∆∆Ct法计算miR-488-3p相对表达量。引物序列：miR-488-3p，正向5’-CGGGGCAGCUCAGUACAG-3’，反向5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，反向5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’。
1.2.3 细胞活力检测将HK-2细胞以5×103/孔的密度接种至96孔板，对各组细胞进行相应处理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。37℃避光孵育3 h后，用酶标仪测量450 nm处的吸光度，并计算细胞活力。
1.2.4 IL-10、IL-1β、TNF-α水平检测收集各组HK-2细胞培养液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中IL-10、IL-1β、TNF-α水平。
1.2.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）平均荧光强度、MDA、SOD水平检测收集各组HK-2细胞，PBS洗涤3次后，加入10 μmol/L DCFH-DA混合均匀，在37 ℃下孵育30 min。用PBS洗涤细胞3次，以充分去除未渗透细胞的DCFH-DA，在荧光显微镜下观察HK-2细胞中ROS平均荧光强度变化。按照试剂盒说明书检测HK-2细胞中MDA、SOD水平。
1.2.6 细胞凋亡率检测收集各组HK-2细胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤后，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.7 cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白表达水平检测收集各组HK-2细胞，RIPA裂解并提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，取45 μg等量蛋白进行电泳分离，转至PVDF膜。用5%脱脂牛奶阻断膜1 h，TBST洗涤膜3次后，将膜与一抗[cleaved caspase-3（1∶4 000稀释）、Bax（1∶6 000稀释）、cGAS（1∶4 000稀释）、GAPDH（1∶3 000稀释）、STING（1∶5 000稀释）在4 ℃下孵育过夜。用TBST洗涤膜3次，加入二抗（1∶10 000稀释）]室温下孵育1 h，用TBST洗涤3次，ECL显色。使用ImageJ软件对图像进行量化。
1.3 统计学分析用Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析和事后SNK-q检验进行多组比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组HK-2细胞中miR-488-3p表达及细胞活力比较与对照组（1.00±0.00，99.43%±0.35%）比较，HR组细胞中miR-488-3p表达（1.96±0.17）升高，细胞活力（67.51%±3.12%）降低（P < 0.05）；与HR组或抑制对照组（2.01±0.18，66.82%±3.15%）比较，miR-488-3p抑制组细胞中miR-488-3p表达（1.23±0.09）降低，细胞活力（82.29%±3.78%）升高（P < 0.05）；与HR组比较，RocA组细胞中miR-488-3p表达（1.98±0.16）差异无统计学意义（P > 0.05），细胞活力（54.95%±2.67%）降低（P < 0.05）；与miR-488-3p抑制组比较，miR-488-3p抑制+RocA组细胞中miR-488-3p表达（1.26±0.11）差异无统计学意义（P > 0.05），细胞活力（71.36%±3.31%）降低（P < 0.05）。
2.2 抑制miR-488-3p表达对HK-2细胞IL-10、IL-1β、TNF-α水平的影响与对照组比较，HR组细胞上清液中IL-10水平降低，IL-1β、TNF-α水平升高（P < 0.05）；与HR组、抑制对照组比较，miR-488-3p抑制组细胞上清液中IL-10水平升高，IL-1β、TNF-α水平降低（P < 0.05）；与HR组比较，RocA组细胞上清液中IL-10水平降低，IL-1β、TNF-α水平升高（P < 0.05）；与miR-488-3p抑制组比较，miR-488-3p抑制+RocA组细胞上清液中IL-10水平降低，IL-1β、TNF-α水平升高（P < 0.05）。见表 1。
| Group | IL-10 | IL-1β | TNF-α |
| Control | 76.65±3.14 | 26.78±1.32 | 115.56±5.69 |
| HR | 39.73±1.751) | 59.93±2.461) | 20.34±10.881) |
| Inhibition control | 40.26±1.98 | 60.28±2.51 | 205.51±11.01 |
| miR-488-3p inhibition | 65.93±3.082),3) | 34.45±1.682),3) | 136.56±6.232),3) |
| RocA | 31.44±1.432) | 68.45±3.052) | 261.56±1.732) |
| miR-488-3p inhibition+RocA | 53.39±2.174) | 47.55±2.194) | 16.25±8.124) |
| 1) P < 0.05 vs. control group; 2) P < 0.05 vs. HR group; 3) P < 0.05 vs. inhibition control group; 4) P < 0.05 vs. miR-488-3p inhibition group. n=6. | |||
2.3 抑制miR-488-3p表达对HK-2细胞中ROS平均荧光强度、MDA、SOD水平的影响
与对照组比较，HR组细胞中SOD水平降低，ROS平均荧光强度、MDA水平升高（P < 0.05）；与HR组、抑制对照组比较，miR-488-3p抑制组细胞中SOD水平升高，ROS平均荧光强度、MDA水平降低（P < 0.05）；与HR组比较，RocA组细胞中SOD水平降低，ROS平均荧光强度、MDA水平升高（P < 0.05）；与miR-488-3p抑制组比较，miR-488-3p抑制+RocA组细胞中SOD水平降低，ROS平均荧光强度、MDA水平升高（P < 0.05），见图 1、表 2。
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| A, control group; B, HR group; C, inhibiton control group; D, miR-488-3p inhibition group; E, RocA group; F, miR-488-3p inhibition+RocA group. 图 1 各组HK-2细胞中ROS平均荧光强度DCFH-DA染色×200 Fig.1 The average fluorescence intensity of ROS in HK-2 cells DCFH-DA staining× 200 |
| Group | Arerage fluorescence intensity of ROS | MDA (mmol/mL) | SOD (U/mL) |
| Control | 16.22±0.79 | 1.23±0.14 | 285.69±1.83 |
| HR | 37.75±1.781) | 5.56±0.211) | 167.73±8.261) |
| Inhibition control | 38.05±1.93 | 5.62±0.23 | 169.52±8.29 |
| miR-488-3p inhibition | 21.16±0.972),3) | 2.08±0.102),3) | 251.52±1.212),3) |
| RocA | 44.55±2.032) | 6.72±0.292) | 138.77±6.712) |
| miR-488-3p inhibition+RocA | 30.41±1.464) | 4.01±0.184) | 200.33±9.824) |
| 1) P < 0.05 vs. control group; 2) P < 0.05 vs. HR group; 3) P < 0.05 vs. inhibiton control group; 4) P < 0.05 vs. miR-488-3p inhibition group. n=6. | |||
2.4 抑制miR-488-3p表达对HK-2细胞凋亡的影响
与对照组（3.16%±0.12%）比较，HR组细胞凋亡率（16.88%±0.79%）升高（P < 0.05）；与HR组、抑制对照组（17.01%±0.82%）比较，miR-488-3p抑制组细胞凋亡率（6.29%±0.31%）降低（P < 0.05）；与HR组比较，RocA组细胞凋亡率（21.22%±1.03%）升高（P < 0.05）；与miR-488-3p抑制组比较，miR-488-3p抑制+RocA组细胞凋亡率（10.95%±0.43%）升高（P < 0.05）。见图 2。
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| A, control group; B, HR group; C, inhibiton control group; D, miR-488-3p inhibition group; E, RocA group; F, miR-488-3p inhibition+RocA group. 图 2 HK-2细胞凋亡的流式细胞术检测结果 Fig.2 Flow cytometry detection results of HK-2 cell apoptosis |
2.5 抑制miR-488-3p表达对各组细胞中cleaved caspase-3、Bax及cGAS-STING通路蛋白表达的影响
与对照组（0.78±0.07，0.52±0.05，0.36±0.03，0.12±0.01）比较，HR组HK-2细胞中cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白表达水平（1.89±0.14，1.43±0.12，1.01±0.09，0.72±0.07）升高（P < 0.05）；与HR组、抑制对照组（1.91±0.16，1.45±0.13，1.03±0.10，0.70±0.06）比较，miR-488-3p抑制组HK-2细胞中cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白表达水平（0.97±0.08，0.73±0.07，0.47±0.04，0.28±0.02）降低（P < 0.05）；与HR组比较，RocA组HK-2细胞中cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白表达水平（2.37±0.15，1.92±0.14，1.39±0.12，0.89±0.08）升高（P < 0.05）；与miR-488-3p抑制组比较，miR-488-3p抑制+RocA组HK-2细胞中cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白表达水平（1.51±0.13，1.04±0.09，0.73±0.07，0.51±0.05）升高（P < 0.05）。见图 3。
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| 1, control group; 2, HR group; 3, inhibition control group; 4, miR-488-3p inhibition group; 5, RocA group; 6, miR-488-3p inhibition+RocA group. 图 3 HK-2细胞中cleaved caspase-3、Bax、cGAS、STING蛋白检测 Fig.3 Detection of cleaved caspase-3, Bax, cGAS, and STING proteins in HK-2 cells |
3 讨论
AKI已被公认为影响全球数百万患者的重大公共卫生问题[8-9]。本研究通过缺氧复氧处理肾小管上皮细胞HK-2模拟体内AKI过程，结果发现炎症反应参与了HK-2细胞的损伤过程，与其他研究[10]结果一致。
研究显示，ROS产生过量引起的氧化应激是肾小管上皮细胞损伤的主要原因[11]，SOD可抑制随后的脂质过氧化，而MDA可促进脂质过氧化，从而对细胞造成损伤[12]。本研究中，HR组HK-2细胞中SOD水平低于对照组，ROS平均荧光强度、MDA水平高于对照组，证实了缺氧复氧诱导的HK-2细胞存在氧化应激。ROS参与肾损伤的发生和发展，破坏线粒体功能，促进炎症，加速细胞凋亡[13]。cleaved caspase-3是由caspase-3剪切后形成，被认为是细胞凋亡的标志[14]。抑制Bax表达可改善缺氧复氧诱导的肾小管上皮细胞凋亡[15]。本研究中，HR组HK-2细胞凋亡率、cleaved caspase-3、Bax蛋白表达水平均高于对照组，表明缺氧复氧诱导了HK-2细胞凋亡。提示抑制炎症、氧化应激及细胞凋亡可能是减轻缺氧复氧诱导的HK-2细胞损伤的有效途径。
miR-488可抑制缺氧复氧心肌H9c2细胞氧化应激和细胞凋亡，进而减轻细胞损伤[16]。本研究中，经缺氧复氧处理后的HK-2细胞中miR-488-3p表达上调，于是对缺氧复氧诱导的HK-2细胞进行了下调miR-488-3p表达的处理，结果发现，下调miR-488-3p表达可抑制缺氧复氧诱导的HK-2细胞炎症、氧化应激及细胞凋亡，进而减轻细胞损伤。提示miR-488-3p可能成为治疗AKI的潜在有效靶点之一。
cGAS-STING通路在肾损伤中起着至关重要的作用[17]。如抑制cGAS-STING通路可减少顺铂诱导的人肾小管上皮细胞HKC-8凋亡，缓解炎症，改善氧化应激，缓解AKI[18]。本研究中，与HR组比较，RocA组HK-2细胞中cGAS、STING蛋白表达上调，炎症反应、氧化应激及细胞凋亡增加。为了进一步验证以上结果，本研究用cGAS-STING通路激活剂RocA设置了回复实验，结果显示，RocA逆转了下调miR-488-3p表达对缺氧复氧诱导的HK-2细胞炎症、氧化应激及细胞凋亡的影响。进一步证实cGAS-STING通路的激活参与了缺氧复氧诱导的HK-2细胞损伤过程。
综上所述，本研究发现下调miR-488-3p表达能够抑制缺氧复氧诱导的HK-2细胞炎症、氧化应激及细胞凋亡，进而减轻细胞损伤，其机制可能与抑制cGAS-STING通路激活有关。本研究结果可能为AKI的治疗提供新的参考依据。
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