2025, Vol. 54文章信息
- 张凤英, 汤永红, 谢言青, 李敏, 蒋莉, 吴娜, 潘兆, 唐颖峰, 袁玲, 洪嫄媛, 刘会, 张平
- ZHANG Fengying, TANG Yonghong, XIE Yanqing, LI Min, JIANG Li, WU Na, PAN Zhao, TANG Yingfeng, YUAN Ling, HONG Yuanyuan, LIU Hui, ZHANG Ping
- 过表达Slc1a2调节Glu/GABA平衡抑制铁死亡改善睡眠剥夺小鼠的认知功能障碍
- Overexpression of Slc1a2 regulates Glu/GABA balance, inhibits ferroptosis and improves cognitive dysfunction in sleep-deprived mice
- 中国医科大学学报, 2025, 54(11): 967-976
- Journal of China Medical University, 2025, 54(11): 967-976
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文章历史
- 收稿日期：2024-11-27
- 网络出版时间：2025-11-21 13:03:52
引用本文 |
2. 衡阳市新安康复医院内科, 湖南 衡阳 421001
2. Department of Internal Medicine, Hengyang Xin'an Rehabilitation Hospital, Hengyang 421001, China
目前，睡眠障碍是普遍存在的问题[1]，其中受睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）影响的人数约占1/3[2]。短期SD可造成情绪压力、注意力持续时间缩短、学习和记忆障碍以及白天嗜睡增加等问题，而长期SD会显著增加心脏病、高血压、肥胖症、脑卒中、糖尿病和阿尔茨海默病等疾病的风险[3]。研究[4]表明，SD可导致认知功能下降和情绪调节中断。前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）是调节工作记忆、注意力和推理等高级大脑功能的关键区域，其功能和结构的完整性对维持神经心理活动至关重要[5-6]。此外，PFC功能与睡眠质量密切相关，睡眠质量改变可能直接影响其功能[7-8]。然而，SD影响PFC功能的具体机制尚不完全清楚。谷氨酸（glutamate，Glu）是主要的兴奋性神经递质，而γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是主要的抑制性神经递质，它们之间的平衡破坏会导致神经发育障碍、神经变性、神经疾病以及急性神经障碍[9]。研究[10]表明，SD导致Glu/GABA代谢失衡，从而影响神经元信号传导和整体大脑功能。Slc1a2基因编码参与Glu转运的兴奋性氨基酸转运蛋白2（excitatory amino acid transporter 2，EAAT2）的表达，其作为一种主要在星形胶质细胞中表达的高效Glu转运蛋白，可调节Glu水平以防止其过度积累引起神经毒性[11-13]。研究[14]表明，Slc1a2在SD大鼠PFC中表达下调，这可能导致Glu/GABA循环紊乱。近年来研究[15]发现睡眠不足导致的认知功能障碍与大脑中铁沉积的增加有关，此外Glu过度积累可导致细胞内谷胱甘肽耗尽并诱导铁死亡[16]。本研究探讨过表达Slc1a2对SD小鼠睡眠时间、认知功能以及PFC中Glu/GABA代谢、GABA能神经元功能和铁死亡的影响，旨在为Slc1a2作为睡眠障碍治疗的潜在靶点提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组130只8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠购自北京Vital River实验动物技术有限公司，体重20~25 g，于60%~65%湿度、22~25 ℃、12 h昼夜光照循环的环境下饲养，自由摄食饮水。按照随机数字表法将小鼠分为正常睡眠（NS）组、正常睡眠+过表达Slc1a2组（NS+ov-Slc1a2组）、SD组、SD+过表达对照组（SD+ov-NC组）和SD+过表达Slc1a2组（SD+ov-Slc1a2组），每组26只。本研究获得中国医科大学实验动物福利与伦理委员会批准（CMUKT2024130）。
1.2 主要试剂及仪器腺病毒（上海吉凯基因医学科技股份有限公司），异氟烷（美国Sigma-Aldrich公司），多聚甲醛（上海碧云天生物技术股份有限公司），免疫荧光和Western blotting检测使用的抗体以及铁水平检测试剂盒（英国abcam公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），第一链cDNA合成试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司），实时定量PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），C11-BODIPY探针（美国Sigma-Aldrich公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司），Medusa小动物EP记录系统[易格生物科技（南京）有限公司]，Lunion Stage自动睡眠评分软件（上海麓联智能科技有限公司），XR-XS108型自动化系统（上海鑫软计算机技术有限公司），CFX96实时荧光定量PCR系统（美国Bio-Rad公司），Image Quant LAS 4000C凝胶成像系统（美国GE公司）。
1.3 方法 1.3.1 SD模型制备使用基于旋转杆的自动化系统制备SD小鼠模型[17]。将小鼠置于可自由摄食的笼子中，笼子底部的杆顺时针和逆时针旋转。顺时针和逆时针各3圈交替进行，每旋转6圈暂停18 s使小鼠摄食饮水。每日杆以5 r/min的速度从20：00旋转至次日16：00以防止小鼠睡眠，持续7 d [17]。
1.3.2 小鼠脑内腺病毒注射小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后固定于脑立体定位仪上。暴露头骨，使用微量注射器将5 μL过表达对照或过表达Slc1a2腺病毒（4×1010 PFU/mL，上海吉凯基因医学科技股份有限公司）注射到小鼠双侧PFC中（前囟前1.8 mm，中线向左或右0.3 mm，深度2.5 mm），注射速度为0.2 μL/min，注射后将注射器再固定10 min防止拔出时回流[18]。
1.3.3 各组小鼠处理方法SD组、SD+ov-NC组和SD+ov-Slc1a2组小鼠按1.3.1方法建立SD模型，NS组和NS+ov-Slc1a2组小鼠仅置于装置中而不进行SD。NS+ov-Slc1a2组、SD+ov-NC组和SD+ov-Slc1a2组于SD模型建立前7 d按1.3.2方法进行腺病毒注射，1次/d，持续7 d。SD造模结束后，每组随机选取10只小鼠进行睡眠时间检测。每组余下的16只小鼠中随机选择10只依次进行旷场试验、Y迷宫实验和新物体识别测试。行为学检测结束后，每组16只小鼠中随机选取10只小鼠用于全细胞膜片钳记录，随机选取3只小鼠灌注取脑用于免疫荧光检测，随机选取3只小鼠收集PFC组织进行Western blotting、实时定量PCR和铁死亡检测。
1.3.4 睡眠时间检测将小鼠用2.5%（质量分数）异氟烷麻醉后置于脑立体定位仪中，将4根电极线分别插入左额叶（前囟前3.0 mm，中线向左0.8 mm，深度3.5 mm）、右额叶（前囟前3.0 mm，中线向右0.8 mm，深度3.5 mm）、左顶叶（前囟后2.0 mm，中线向左2.5 mm，深度1.8 mm）和右顶叶（前囟后2.0 mm，中线向右2.5 mm，深度1.8 mm）记录脑电图，将1对绝缘电极插入颈部肌肉记录肌电图，使用Medusa小动物EP记录系统以1 000 Hz的采样率记录脑和肌肉电活动。使用Lunion Stage自动睡眠评分软件将睡眠状态分为清醒、快速眼动（rapid eye movement，REM）睡眠和非快速眼动（non-rapid eye movement，NREM）睡眠。清醒的特征是脑电图振幅低、频率高的同时肌肉张力升高。REM睡眠通过脑电图中的高θ（6~10 Hz）功率和肌肉力量的缺失识别。NREM睡眠的特征是脑电图显示高电压和低频（1~4 Hz）信号同时肌电图活动减少[19]。在12 h内记录各组小鼠每小时的清醒情况，并统计每隔3 h的NREM睡眠时间、REM睡眠时间和觉醒时间。
1.3.5 行为学检测在旷场实验中，将小鼠放置在1个分为4个象限的方形竞技场中，在标准照明下评估它们在中心区域的运动和时间，持续10 min[20]，记录运动的总距离和中心区域停留时间。Y迷宫实验涉及3只手臂，在训练阶段阻断1只手臂，小鼠可以探索2只张开的手臂10 min，1 h后打开阻断的手臂并让小鼠探索所有手臂5 min以检验他们对新打开手臂的偏好[21]，记录小鼠的平均速度并计算新臂选择指数：新臂选择指数（%）=在新臂中时间/（在新臂中时间+在旧臂中时间）×100。在新物体识别测试中，小鼠首先适应包含2个相同物体的装置5 min，间隔2 h后用新物体替换其中1个旧物体，并在5 min内检测小鼠对每个物体的探索以计算识别指数，即在新对象中花费的时间与测试总持续时间的比值[19]
1.3.6 全细胞膜片钳记录小鼠用异氟烷深入麻醉后断头取脑，将大脑浸入预冷的充氧解剖液中，用冷冻切片机将大脑切成厚300 μm的切片。将切片转移到人工脑脊液中，30 ℃孵育1 h。在持续灌流人工脑脊液、31 ℃以及前置电压-70 mV条件下记录微型兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currentsm，mEPSC）。
1.3.7 免疫荧光检测小鼠异氟烷麻醉后依次用生理盐水和4%（质量分数）多聚甲醛灌注，提取完整大脑组织并在4%多聚甲醛中固定48 h，用30%（质量分数）蔗糖溶液脱水后切割成40 µm的脑切片。用含0.01%（体积分数）Triton X-100和10%（体积分数）山羊血清的PBS封闭后，Slc1a2、胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和GABA一抗4 ℃孵育切片过夜。PBS洗涤切片3次，于室温下用荧光二抗孵育1 h，DAPI染色液复染细胞核，于荧光显微镜下观察并拍照。计算Slc1a2+GFAP+细胞比例和GABA阳性细胞率。Slc1a2+GFAP+细胞比例（%）= Slc1a2阳性细胞数/GFAP阳性细胞数×100；GABA阳性细胞率（%）= GABA阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100。
1.3.8 Western blotting检测用含1%（体积分数）PMSF的RIPA裂解液裂解PFC组织样本，BCA法检测提取蛋白的浓度，将蛋白样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶并进行电泳分离，将凝胶上分离的蛋白转移到PVDF膜上。5%（体积分数）脱脂牛奶室温封闭1 h，Slc1a2和α-tubulin一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后室温下用二抗孵育1 h，TBST洗去多余抗体并进行ECL发光成像，使用ImageJ软件定量分析Slc1a2蛋白的相对表达。
1.3.9 实时定量PCR检测用TRIzol法提取PFC组织总RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒将RNA转化为cDNA。使用实时定量PCR试剂盒进行检测。以α-tubulin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因Glul、Slc6a1和Abat mRNA的相对表达量。
1.3.10 铁死亡检测收集的新鲜PFC组织切成厚10 μm的冰冻切片后用C11-BODIPY探针孵育，DAPI染核后于荧光显微镜下观察并拍照。ImageJ软件计算荧光强度，活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平为绿色荧光强度与红色荧光强度的比值。Fe2+和MDA水平的检测严格按照相关试剂盒说明书进行操作。
1.4 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0处理数据。符合正态分布的计量资料以x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验（方差齐）和Dunnett T3检验（方差不齐）。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 SD模型评估频谱分析结果显示，SD组小鼠相较于NC组表现出易醒性以及REM和NREM睡眠时间减少，表明SD模型建立成功。见图 1。
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| A, NS group; B, SD group. EEG, electroencephalogram; EMG, electromyography; WEAK, awakening; NREM, non-rapid eye movement; REM, rapid eye movement. 图 1 小鼠脑电图、肌电图和睡眠状态分析 Fig.1 Analysis of electroencephalograms, electromyograms, and sleep status in mice |
2.2 各组小鼠PFC中Slc1a2表达情况
结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠PFC中Slc1a2+GFAP+细胞比例升高（P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠Slc1a2+GFAP+细胞比例降低（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠Slc1a2+GFAP+细胞比例升高（均P < 0.05）。Western blotting检测结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠PFC中Slc1a2蛋白表达升高（P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠PFC中Slc1a2蛋白表达降低（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠PFC中Slc1a2蛋白表达升高（均P < 0.05）。见图 2、3，表 1。
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| 图 2 免疫荧光检测各组小鼠PFC中Slc1a2+GFAP+细胞比例×200 Fig.2 Proportion of Slc1a2+GFAP+ cells in the PFC of mice in each group by immunofluorescence ×200 |
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| 图 3 Western blotting检测各组小鼠PFC中Slc1a2蛋白表达 Fig.3 Slc1a2 protein expression in the PFC of mice in each group by Western blotting |
| Group | n | Slc1a2+GFAP+ cell (%) | Slc1a2 protein |
| NS | 3 | 44.03±4.60 | 0.52±0.04 |
| NS+ov-Slc1a2 | 3 | 64.82±5.221) | 0.76±0.051) |
| SD | 3 | 5.37±0.761) | 0.15±0.021) |
| SD+ov-NC | 3 | 5.27±1.071) | 0.18±0.061) |
| SD+ov-Slc1a2 | 3 | 24.67±6.952),3) | 0.45±0.042),3) |
| F | 57.86 | 52.99 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05;2) compared with the SD group, P < 0.05;3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | |||
2.3 各组小鼠睡眠时间比较
与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠NREM和REM睡眠时间增加，觉醒时间减少（均P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠NREM和REM睡眠时间减少，觉醒时间增加（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠NREM和REM睡眠时间增加，觉醒时间减少（均P < 0.05）。见表 2。
| Group | n | NREM | REM | Awakening time |
| NS | 10 | 92.17±6.44 | 15.79±2.84 | 72.36±5.23 |
| NS+ov-Slc1a2 | 10 | 105.21±5.051) | 19.79±2.281) | 55.00±6.461) |
| SD | 10 | 50.38±7.051) | 7.35±1.921) | 102.74±5.541) |
| SD+ov-NC | 10 | 55.1±7.181) | 7.44±2.271) | 105.9±5.211) |
| SD+ov-Slc1a2 | 10 | 71.37±7.552),3) | 10.52±2.362),3) | 89.13±7.482),3) |
| F | 71.44 | 27.82 | 66.26 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05;2) compared with the SD group, P < 0.05;3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | ||||
2.4 各组小鼠Glu和GABA代谢酶表达情况
实时定量PCR检测结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠PFC中Glul、Slc6a1和Abat mRNA表达升高（均P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠PFC中Glul、Slc6a1和Abat mRNA表达降低（均P < 0.05）；与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠PFC中Glul、Slc6a1和Abat mRNA表达升高（均P < 0.05）。见表 3。
| Group | n | Glul mRNA | Slc6a1 mRNA | Abat mRNA |
| NS | 3 | 1.01±0.05 | 0.98±0.05 | 1.01±0.08 |
| NS+ov-Slc1a2 | 3 | 2.48±0.271) | 2.82±0.611) | 1.75±0.261) |
| SD | 3 | 0.52±0.131) | 0.34±0.041) | 0.29±0.051) |
| SD+ov-NC | 3 | 0.52±0.091) | 0.35±0.031) | 0.30±0.081) |
| SD+ov-Slc1a2 | 3 | 0.65±0.112),3) | 0.52±0.062),3) | 0.59±0.062),3) |
| F | 56.67 | 166.10 | 241.80 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05;2) compared with the SD group, P < 0.05;3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | ||||
2.5 各组小鼠PFC中GABA能神经元功能变化
结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠PFC中mEPSC频率和振幅、GABA阳性细胞率升高（均P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠PFC中mEPSC频率和振幅、GABA阳性细胞率降低（均P < 0.05）；与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠PFC中mEPSC频率和振幅、GABA阳性细胞率升高（均P < 0.05）。见图 4、表 4。
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| 图 4 免疫荧光检测各组小鼠PFC中GABA阳性细胞×200 Fig.4 GABA positive cells in the PFC of mice in each group by immunofluorescence ×200 |
| Group | Frequency of mEPSC (Hz, n=10) | Amplitude of mEPSC (pA, n=10) | GABA-positive cells rate (%, n=3) |
| NS | 4.92±0.24 | 18.67±1.24 | 89.49±2.86 |
| NS+ov-Slc1a2 | 5.13±0.071) | 21.04±1.231) | 94.19±3.071) |
| SD | 2.11±0.361) | 10.61±1.301) | 12.36±2.51) |
| SD+ov-NC | 2.17±0.321) | 10.43±1.241) | 12.79±1.791) |
| SD+ov-Slc1a2 | 4.73±0.542),3) | 16.28±1.172),3) | 58.90±3.892),3) |
| F | 164.70 | 111.60 | 520.80 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05;2) compared with the SD group, P < 0.05;3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | |||
2.6 各组小鼠PFC中铁死亡比较
结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠PFC中脂质ROS、Fe2+和MDA水平降低（均P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠PFC中脂质ROS、Fe2+和MDA水平升高（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠PFC中脂质ROS、Fe2+和MDA水平降低（均P < 0.05）。见图 5、表 5。
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| 565 nm, excitation light is 565 nm, red; 488 nm, excitation light is 488 nm, green. 图 5 C11-BODIPY探针荧光染色检测各组小鼠PFC中脂质ROS阳性细胞表达×200 Fig.5 Expression of lipid ROS positive cells in the PFC of mice in each group by C11-BODIPY probe fluorescence staining ×200 |
| Group | n | ROS | Fe2+(μmol/g) | MDA(μmol/mg) |
| NS | 10 | 0.66±0.06 | 2.15±0.13 | 4.37±0.26 |
| NS+ov-Slc1a2 | 10 | 0.33±0.081) | 1.80±0.121) | 3.57±0.281) |
| SD | 10 | 1.91±0.131) | 4.78±0.181) | 8.12±0.441) |
| SD+ov-NC | 10 | 1.99±0.131) | 4.84±0.141) | 8.46±0.321) |
| SD+ov-Slc1a2 | 10 | 1.41±0.082),3) | 3.20±0.172),3) | 6.83±0.352),3) |
| F | 74.39 | 918.60 | 430.50 | |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05;2) compared with the SD group, P < 0.05;3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | ||||
2.7 各组小鼠认知功能比较
旷场实验结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠中心区域停留时间增加（P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠中心区域停留时间减少（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠中心区域停留时间增加（均P < 0.05）。各组小鼠总距离比较无统计学差异（均P > 0.05）。新物体识别测试结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠识别指数增加（P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠识别指数减少（均P < 0.05）。与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠识别指数增加（均P < 0.05）。Y迷宫实验结果显示，与NS组相比，NS+ov-Slc1a2组小鼠新臂选择指数增加（P < 0.05），SD组和SD+ov-NC组小鼠新臂选择指数减少（均P < 0.05）；与SD组和SD+ov-NC组相比，SD+ov-Slc1a2组小鼠新臂选择指数增加（均P < 0.05）。各组小鼠平均速度比较无统计学差异（均P > 0.05）。见表 6。
| Group | n | Open field experiment | New object recognition test[recognition index (%)] | Y maze experiment | ||
| Total distance (m) | Stay time in the central area (s) | Average speed (cm/s) | Novel arm choice index (%) | |||
| NS | 10 | 17.03±1.87 | 56.50±5.52 | 59.87±3.10 | 16.73±1.16 | 50.86±5.46 |
| NS+ov-Slc1a2 | 10 | 17.93±0.91 | 61.90±2.511) | 64.01±2.811) | 16.88±0.50 | 64.22±4.311) |
| SD | 10 | 16.41±2.89 | 27.10±1.851) | 38.02±2.701) | 16.70±1.34 | 33.74±2.001) |
| SD+ov-NC | 10 | 16.24±2.27 | 27.80±1.691) | 37.00±3.211) | 16.50±1.33 | 32.31±3.101) |
| SD+ov-Slc1a2 | 10 | 15.81±3.02 | 44.30±3.402),3) | 53.35±4.472),3) | 17.17±1.59 | 45.41±2.672),3) |
| F | 0.39 | 165.90 | 107.20 | 0.43 | 64.38 | |
| P | 0.76 | < 0.001 | < 0.001 | 0.73 | < 0.001 | |
| 1) compared with the NS group, P < 0.05, 2) compared with the SD group, P < 0.05, 3) compared with the SD+ov-NC group, P < 0.05. | ||||||
3 讨论
SD会对个体的情绪和认知功能产生不利影响，目前临床治疗面临挑战[22-23]。Slc1a2是主要表达于星形胶质细胞质膜上的Glu转运体，主要发挥维持细胞外Glu浓度的作用，可缩短突触处的Glu瞬时现象，从而抑制突触和突触外Glu受体的激活并将兴奋性传递到睡眠和觉醒促进神经元，最终控制睡眠-觉醒行为[24]。研究[14]表明，Slc1a2在SD大鼠PFC中表达下调，且增强其表达可改善SD诱导的大鼠躁狂样行为。本研究使用基于螺旋杆的自动化系统建立小鼠SD模型，发现SD小鼠NREM和REM睡眠时间减少，觉醒时间增加，表明SD小鼠模型建立成功。本研究结果显示，SD模型小鼠PFC中Slc1a2+GFAP+细胞比例降低，且小鼠PFC中Slc1a2蛋白表达下调，与既往研究[14]结果一致。此外，本研究发现在SD小鼠PFC中过表达Slc1a2可增加NREM和REM睡眠时间，减少觉醒时间，表明PFC中异位过表达Slc1a2可改善SD小鼠睡眠障碍。
研究[25-26]表明，SD影响大脑内的神经活动，特别是改变PFC区域抑制控制和激活之间的平衡。Slc1a2在Glu转运和神经信号转导中发挥关键作用，而且由于Glu和GABA分别是主要的兴奋性和抑制性神经递质，Glu代谢和GABA合成之间的平衡对大脑功能至关重要[27]。Glul是氮代谢途径中的关键中心酶之一，其通过ATP依赖性反应催化Glu和铵转化为谷氨酰胺[28]。Slc6a1编码位于突触前神经元和神经胶质上的GABA转运体1，该转运体通过钠氯依赖的再摄取机制高效清除突触间释放的GABA[29]。GABA转氨酶Abat是参与GABA分解代谢的关键酶，位于线粒体基质内并催化GABA的氨基转移到α-酮戊二酸，形成琥珀酸半醛并随后转化为三羧酸循环中的关键中间体琥珀酸[30]。Glul、Slc6a1和Abat表达可间接反应Glu代谢和GABA合成之间的平衡。本研究发现SD小鼠PFC中Glul、Slc6a1和Abat mRNA表达下调，而在PFC中过表达Slc1a2可部分逆转SD小鼠PFC中Glul、Slc6a1和Abat mRNA表达，表明过表达Slc1a2可改善SD小鼠PFC中Glu/GABA代谢失衡。
GABA是神经系统中主要的抑制性神经递质，其活性导致神经元超极化，抑制放电并在神经网络中发挥抑制作用[31]。mEPSC对应于由单个Glu囊泡的突触前释放引起的反应，mEPSC振幅增加反映了突触后传递的加强，而频率增加反映了功能性突触数量或突触前释放概率的增加[32]。本研究发现SD小鼠PFC中mEPSC频率和振幅降低，而过表达Slc1a2可恢复SD小鼠PFC中mEPSC频率和振幅，表明过表达Slc1a2能改善SD小鼠PFC中的兴奋性神经信号传递。GABA能神经元对睡眠产生及其调节至关重要[33]。本研究发现SD小鼠PFC中GABA阳性细胞率降低，而过表达Slc1a2增加SD小鼠PFC中GABA阳性细胞率，表明过表达Slc1a2可能改善SD小鼠PFC中的GABA能神经元功能。铁死亡是铁和脂质氧化产物依赖性调节的一种细胞死亡形式，以脂质过氧化、抗氧化酶失活和铁稳态失衡为特征，并与多种脑部疾病有关[34]。谷胱甘肽消耗导致脂质过氧化物积累从而诱导铁死亡[35]。Glu过度积累会导致谷胱甘肽耗竭，进而诱导铁死亡[36]。本研究发现SD小鼠PFC中脂质ROS、Fe2+和MDA水平升高，而过表达Slc1a2降低SD小鼠PFC中脂质ROS、Fe2+和MDA水平，表明过表达Slc1a2可能改善SD小鼠PFC中的铁死亡。
研究[37]表明，SD影响大脑神经网络的结构和功能，动态降低信号处理速度，导致患者反应时间延长和精神状态降低，从而损害注意力、工作记忆、记忆巩固、警觉性、判断力、决策力等认知能力。本研究采用行为测试研究Slc1a2在SD诱导的认知障碍中的作用。旷场实验结果显示，过表达Slc1a2不影响SD小鼠的运动功能，但增加SD小鼠在中心区域的停留时间。此外，新物体识别测试结果显示，过表达Slc1a2增加SD小鼠的识别指数。这些结果表明过表达Slc1a2可能改善SD小鼠焦虑行为和认知能力。Y迷宫结果显示，PFC中过表达Slc1a2增加SD小鼠新臂选择指数，而对小鼠的平均速度无影响，表明过表达Slc1a2改善SD小鼠空间记忆损伤。
综上所述，在PFC中异位过表达Slc1a2能明显改善SD小鼠睡眠障碍，减轻SD对PFC中的兴奋性神经信号传递和GABA能神经元功能的破坏，并改善SD小鼠认知障碍和焦虑行为，其作用机制可能与改善PFC中Glu/GABA代谢失衡并抑制铁死亡有关。然而，Slc1a2不同亚型的作用、参与调节SD的Slc1a2相关的分子通路对神经递质的调节以及对SD诱导的认知和情绪问题的影响仍需进一步研究。
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