创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是神经外科常见的急重症之一，主要是由外力击打头部造成的脑功能障碍和脑神经组织损伤，其继发性的脑水肿可引发颅内高压和脑疝，使TBI具有较高的致残率和致死率，而血脑屏障的破坏是导致创伤性脑水肿发生的主要原因之一^[1]。水通道蛋白（aquaporin，AQP）4作为生物膜通道蛋白家族成员之一，有介导水在不同类型细胞膜间跨膜转运的作用。研究^[2-3]发现，AQP4在各种颅脑疾病导致的脑水肿的形成和消散中发挥关键作用，提示调控AQP4表达可能成为治疗TBI的潜在靶点。醉茄素A是从南非醉茄中提取的一种甾体内酯，可抑制NF-κB活性，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成、抗肿瘤等广泛的药理活性^[4]。研究^[5]报道，醉茄素A可改善缺血性脑卒中大鼠神经行为功能，通过提高机体抗氧化水平抑制神经元凋亡。然而，醉茄素A是否对TBI后脑水肿有改善作用目前鲜有报道。本研究拟通过建立TBI大鼠模型，探讨醉茄素A对TBI大鼠脑组织AQP4表达及脑水肿的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

ZH-ZYQ型自由落体脑损伤模型打击器（安徽正华生物仪器设备有限公司），GelDoc XR System凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），QS5实时荧光定量PCR仪、EVOS M5000荧光显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

醉茄素A（纯度 > 99.0%，成都普思生物科技股份有限公司），伊文思蓝（美国Sigma公司），AQP4、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3及β-actin抗体（英国abcam公司），HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司），RIPA裂解缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光，上海碧云天生物技术股份有限公司）。

SPF级SD雄性大鼠共75只，6周龄，体重200~220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（渝）2018-0003。实验前适应性喂养1周，自由饮水和摄食。本研究获得南华大学附属第二医院伦理委员会批准（2023032）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备与分组

参考文献[6]，采用自由落体打击法建立TBI模型。将麻醉后大鼠固定于ZH-ZYQ型自由落体脑损伤模型打击器上，头部备皮并用乙醇擦拭消毒，于右侧颅骨作直径5 mm的圆形骨窗，用25 g砝码从40 cm高处沿导管自由坠落撞击至右侧骨窗硬膜上，止血后用骨蜡封闭骨窗并缝合创面。假手术组不进行打击损伤，仅作骨窗后由骨蜡封闭，即可缝合创面。大鼠在被撞击后出现短暂呼吸抑制则视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组，醉茄素A低、中、高剂量组; 另设置假手术组，每组15只。醉茄素A低、中、高剂量组大鼠分别给予25、50、100 mg/kg醉茄素A腹腔注射，模型组及假手术组大鼠腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续7 d。

1.2.2 神经功能缺损评分（neurological severity score，NSS）

药物干预结束后，参考文献[7]，评估各组大鼠NSS，从运动、感觉、反射和平衡等多方面综合评价，最高分为18分，评分越高则神经功能损伤越严重。

1.2.3 脑组织含水量测定

药物干预结束后，每组随机选取5只大鼠取出全脑组织，滤纸吸干后称脑湿重，于85 ℃恒温干燥箱中持续烘干24 h后称脑干重。脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100。

1.2.4 血脑屏障通透性测定

药物干预结束后，每组随机选取5只大鼠，以5 mL/kg的剂量经静脉注射2.5%伊文思蓝，注射后立即处死大鼠取出脑组织，生理盐水洗净血液，置于10%三氯醋酸中沉淀蛋白，加入无水乙醇，匀浆机充分匀浆后离心取上清，再将上清液置于37 ℃水浴锅中水浴48 h，于酶标仪上设定波长620 nm检测光密度（optical density，OD）值，根据标准曲线计算脑组织中伊文思蓝含量。

1.2.5 HE染色

取损伤侧部分大脑皮层组织，于4%多聚甲醛中固定24 h，组织脱水后石蜡包埋，作连续5 μm切片，行常规HE染色，显微镜下观察组织病理改变。

1.2.6 TUNEL染色

取损伤侧部分海马组织，4%多聚甲醛室温固定2 h，用冰冻切片机按厚度14 μm切片，随后按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，绿色荧光标记，抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。选取3个非连续切片，统计海马CA1区TUNEL染色阳性细胞数量，取均值作为海马组织细胞凋亡水平。

1.2.7 实时定量PCR

取损伤侧部分大脑皮层组织，研磨后匀浆，采用TRIzol试剂盒提取总RNA，反转录后对互补的DNA链定量测定。将cDNA产物2 μL、SYBR预混液16 μL、上下游引物各1 μL，于95 ℃预变性90 s，60℃退火40 s，72 ℃延伸30 s条件下进行实时定量PCR扩增，共45个循环。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算大脑皮层组织中AQP4 mRNA相对表达量。引物序列见表 1。

1.2.8 Western blotting检测

药物干预结束后，取损伤侧部分大脑皮层组织及海马组织，加入适量生理盐水将组织研磨后充分匀浆，于RIPA裂解液中分离蛋白，12 000 r/min离心10 min后取上清，对总蛋白进行定量。将20 μg总蛋白与上样缓冲液均匀混合，100 ℃水浴5 min，离心后上样，10% SDS-PAGE电泳并进行转膜，室温封闭2 h，加入AQP4（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜; 然后加入二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，加入ECL显色液，以β-actin为内参，计算AQP4、Bax、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据用x±s表示。采用单因素方差分析对大鼠NSS、脑含水量、伊文思蓝含量及AQP4 mRNA和蛋白表达水平进行多组间比较，若方差分析结果有统计学意义，则进一步采用LSD-t法进行组间两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠NSS及脑组织含水量比较

与假手术组比较，模型组大鼠NSS及脑组织含水量显著升高（P < 0.01）; 与模型组比较，醉茄素A中、高剂量组大鼠NSS及脑组织含水量显著降低（P < 0.05），而醉茄素A低剂量组无统计学差异（P > 0.05）。见表 2。

2.2 各组大鼠血脑屏障通透性变化

假手术组、模型组及醉茄素A低、中、高剂量组大鼠脑组织中伊文思蓝含量分别为1.43±0.18、5.26±0.34、5.04±0.45、4.11±0.26和2.87±0.21，与假手术组比较，模型组大鼠血脑屏障通透性显著升高（P < 0.01）; 与模型组比较，醉茄素A中、高剂量组大鼠血脑屏障通透性显著降低（P < 0.05），而醉茄素A低剂量组无统计学差异（P > 0.05）。

2.3 各组大鼠大脑皮层组织病理学变化

假手术组大鼠大脑皮层组织结构完整，细胞核形态正常; 模型组和醉茄素A低剂量组大鼠大脑皮层组织细胞核明显固缩，可见胞质透明、轻度水肿，少量神经元变性坏死; 醉茄素A中剂量组大鼠大脑皮层组织细胞核轻度固缩，细胞水肿程度有所减轻，病理形态较模型组明显改善; 醉茄素A高剂量组大鼠大脑皮层组织细胞核形态趋于正常，无明显水肿及神经元变性坏死现象。见图 1。

2.4 各组大鼠海马组织细胞凋亡情况

假手术组大鼠海马组织未见阳性绿色荧光，模型组和醉茄素A低剂量组大鼠海马组织可见大量绿色荧光，醉茄素A中剂量组大鼠海马组织可见少量绿色荧光，醉茄素A高剂量组大鼠海马组织隐约可见绿色荧光。假手术组、模型组、醉茄素A低、中、高剂量组大鼠海马组织细胞TUNEL染色阳性细胞数量分别为（3.03±1.25）个、（34.41±4.70）个、（33.08±4.19）个、（15.54±6.22）个和（7.96±4.87）个，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织细胞凋亡水平显著升高（P < 0.01）; 与模型组比较，醉茄素A中、高剂量组大鼠海马组织细胞凋亡水平显著降低（P < 0.05），而醉茄素A低剂量组无统计学差异（P > 0.05）。见图 2。

2.5 各组大鼠大脑皮层组织AQP4 mRNA及蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮层组织中AQP4 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）; 与模型组比较，醉茄素A中、高剂量组大鼠大脑皮层组织中AQP4 mRNA及蛋白表达水平显著降低（P < 0.05），而醉茄素A低剂量组无统计学差异（P > 0.05）。见图 3。

2.6 各组大鼠海马组织凋亡相关蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高（P < 0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P < 0.01）; 与模型组比较，醉茄素A中、高剂量组大鼠海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P < 0.05），而醉茄素A低剂量组无统计学差异（P > 0.05）。见图 4。

3 讨论

TBI分为外力直接导致的原发性损伤和后续水肿、炎症等引起的继发性损伤。研究^[8]发现，醉茄素A可通过调节小胶质细胞活化和抑制内皮细胞凋亡改善脑水肿，但其在蛋白及基因层面对TBI的作用尚不明确。本研究采用自由落体Feeney法建立TBI大鼠模型，醉茄素A干预后，大鼠皮层神经元结构改善、NSS显著降低，且脑组织含水量与血脑屏障通透性降低，说明醉茄素A具有修复TBI大鼠血脑屏障，改善其脑水肿及神经功能的作用。

AQP是介导水分子跨膜转运的关键蛋白家族，其中AQP4与脑血管疾病关系密切^[9]。AQP4是维持大脑水平衡、调节神经胶质细胞、脑脊液和血管间水分的关键结构基础^[10]。

目前，众多学者致力于探究药物对TBI后继发性脑水肿及AQP4表达的调控作用，旨在开发有效防治继发性脑损伤的策略。熊翱等^[11]研究发现，沉默AQP4表达可显著改善TBI大鼠创伤后脑水肿。同时，汪棋笙等^[12]研究表明，高浓度的丙戊酸钠可通过抑制AQP4蛋白表达，减轻TBI大鼠脑水肿并改善大脑损伤。上述研究结果共同揭示了改善TBI后脑水肿与降低AQP4表达之间存在密切关联。

细胞凋亡是TBI后继发性脑损伤的重要机制。TBI后代谢应激、局部循环障碍及脑水肿加剧缺血缺氧，导致神经细胞在原发损伤基础上发生继发性凋亡^[13]。海马作为边缘叶核心结构，与皮层功能高度整合，共构边缘系统。TBI中，大脑皮层以显著的脑水肿和血脑屏障损伤为特征，而海马区域则因凋亡致功能性神经元丢失，引发神经网络破坏和神经递质失衡，成为认知障碍等神经缺损的主要原因^[14]。尽管AQP4非直接凋亡执行蛋白，但其水通道功能通过介导脑水肿、破坏微环境稳态及放大炎症，间接创造促凋亡微环境，在TBI继发性损伤中发挥关键促凋亡作用^[15]。本研究结果显示，醉茄素A干预显著降低了TBI大鼠脑皮层组织中的AQP4 mRNA及蛋白表达水平，同时抑制海马组织细胞凋亡，并降低凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3表达水平，上调Bcl-2蛋白表达，说明醉茄素A减轻TBI大鼠脑水肿并改善其神经功能缺陷，可能与抑制AQP4表达有关。

综上所述，醉茄素A可能通过抑制AQP4表达减少细胞凋亡，修复TBI大鼠血脑屏障并减轻脑水肿，发挥神经保护作用。但因未设阳性对照组，其临床价值尚待明确，后续需在细胞水平深入探究醉茄素A调控AQP4改善TBI的具体机制。