2025, Vol. 54文章信息
- 杨超, 苏涛, 贾迪, 林岩, 程昊, 张奇, 梁晶, 张春晶
- YANG Chao, SU Tao, JIA Di, LIN Yan, CHENG Hao, ZHANG Qi, LIANG Jing, ZHANG Chunjing
- lncRNA NRON通过调节TGF-β/Smad信号通路诱导心肌梗死小鼠心肌纤维化
- lncRNA NRON induces myocardial fibrosis in mice with myocardial infarction by regulating the TGF-β/Smad signaling pathway
- 中国医科大学学报, 2025, 54(10): 926-930
- Journal of China Medical University, 2025, 54(10): 926-930
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文章历史
- 收稿日期：2024-10-12
- 网络出版时间：2025-10-15 13:45:12
引用本文 |
2. 齐齐哈尔医药科学研究所博士后科研工作站，黑龙江 齐齐哈尔 161006;
3. 齐齐哈尔医学院基础医学院病理生理学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006;
4. 齐齐哈尔医学院医院管理处卫生所，黑龙江 齐齐哈尔 161006;
5. 齐齐哈尔医学院药学院临床药理学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006;
6. 哈尔滨医科大学附属第四医院临床药学科，哈尔滨 150001
2. Postdoctoral Research Station, Qiqihar Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences, Qiqihar 161006, China;
3. Department of Pathophysiology, School of Basic Medicine, Qiqihar Medical University, Qiqihar 161006, China;
4. Department of Clinics, Qiqihar Medical University, Qiqihar 161006, China;
5. Department of Clinical Pharmacology, School of Pharmacy, Qiqihar Medical University, Qiqihar 161006, China;
6. Department of Pharmacy, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China
心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌组织严重持续缺血引起的，其发病率与死亡率均较高[1-2]。心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是MI后的主要病理改变，也是引起心室重塑进而诱发心力衰竭、心律失常甚至猝死的关键原因。因此，抑制MF是改善MI患者预后、治疗MI的重要手段之一[3]。研究[4]表明，多种信号通路参与MF的发生发展，其中，转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad信号通路被认为是MF发生的关键通路。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的功能性RNA分子，在MI、MF等多种心血管疾病中发挥重要调控作用[5]。LUO等[6]研究发现，lncRNA SAIL在MF中表达显著降低，过表达SAIL可减少心肌胶原沉积，减少纤维化相关基因的转录，抑制MF进程。ZHANG等[7]研究发现，lncRNA CFAR作为一种新的促纤维化因子，在心脏中通过调控miR-449a-5p/LOXL3/mTOR通路发挥促纤维化作用。研究[8]发现lncRNA NRON可结合抑制活化T细胞核因子NFAT进而抑制T细胞激活。本课题组前期研究[9]证实，NRON可通过与电压依赖性阴离子通道蛋白VDAC结合并抑制其表达，影响MI后细胞凋亡的发生，但NRON在MF中的作用尚不清楚。本研究拟探讨NRON对MI诱导MF的影响及可能的作用机制，以期为临床提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57BL/6J品系成年雄性小鼠32只，体重22~25 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。小鼠在标准条件下饲养：室温20~25 ℃、湿度50%~60%、正常饮水饮食。本研究获得齐齐哈尔医学院实验动物伦理委员会批准。
1.2 动物分组及建模将32只小鼠随机分成假手术（Sham）组、MI组、MI+敲减NRON（MI+shNRON）组和MI+阴性对照（MI+NC）组，每组8只。Sham组仅开胸不结扎，MI组制备MI模型，MI+shNRON组先向小鼠左心室内注射100 μL敲减NRON慢病毒[1×108 TU/mL，汉恒生物科技（上海）有限公司]，再进行MI造模。MI+NC组先向小鼠左心室内注射阴性对照慢病毒，再进行MI造模。所有小鼠标准饲养28 d后处死，取出心脏组织用于后续实验。小鼠MI模型制备具体方法：将小鼠麻醉后固定，剃除小鼠胸部及腋下毛发，气管插管，连入呼吸机，于第3、4肋间打开胸腔充分暴露心脏，持针器持取7-0结扎线结扎冠状动脉左前降支，阻断血流。观察心电图出现ST段抬高，则表明结扎位置正确，MI模型建立成功。完成后关闭胸腔，逐层缝合肌肉及皮肤。
1.3 HE染色检测心肌组织病理损伤小鼠心脏组织用生理盐水清洗，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后，切成厚度为5 μm的切片，用HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行染色。在显微镜下观察心肌细胞结构及心肌组织病理损伤变化。
1.4 Masson染色检测心肌组织纤维化程度小鼠心脏组织清洗后，浸泡在4%多聚甲醛中固定，然后经石蜡包埋，切片，脱蜡，Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）染色后封片，在光学显微镜下观察蓝染心肌胶原纤维的分布及数量。
1.5 免疫组织化学染色检测心肌组织Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，colⅠ）的表达小鼠心脏组织经清洗、固定、石蜡包埋、切片后，进行脱蜡水化，微波加热法进行抗原修复，山羊血清封闭后加入一抗colⅠ抗体（1∶500稀释，苏州博奥龙科技有限公司），4 ℃孵育过夜。次日加入生物素标记的二抗，37 ℃孵育20 min。滴加适量辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min。二氨基联苯胺显色5 min，苏木素复染3 min后，脱水，封片，置于显微镜下观察切片。
1.6 实时定量PCR检测NRON的表达水平取出小鼠心肌组织，用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒（日本TOYOBO公司）将总RNA逆转录成cDNA，并以cDNA为模板采用SYBR Green染料（瑞士Roche公司）法检测NRON的表达水平。反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45个循环。引物序列：NRON，正向，5’-CAAATCCAGTTGCAAGGACC-3’，反向，5’-AGCTCAGTCCTAGGGTAGG-3’；β-actin，正向，5’-CCACTGCCGCATCCTCTT-3’，反向，5’-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3’；以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
1.7 Western blotting取小鼠心肌组织，加入RIPA裂解液（南京碧云天生物技术有限公司）后离心，取上清，用BCA试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司）测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，取等质量蛋白上样，电泳、转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3（1∶1 000稀释，成都正能生物技术有限责任公司），4 ℃过夜，用PBST漂洗3次，加入二抗（1∶1 000稀释，成都正能生物技术有限责任公司），室温孵育1 h，ECL发光剂（北京索莱宝科技有限公司）显影，采用ImageJ软件分析蛋白灰度值。
1.8 统计学分析应用GraphPad Prism7.0软件对数据进行分析，计量资料以x ± s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组NRON的表达水平比较实时定量PCR结果显示，与Sham组（1.00±0.38）相比，MI组NRON表达（2.16±0.46）升高，与MI组相比，MI+shNRON组NRON表达（1.38±0.33）下降，差异有统计学意义（均P < 0.05）。MI+NC组（2.08±0.32）与MI组相比，NRON表达无统计学差异（P > 0.05）。
2.2 各组心肌组织病理学改变比较HE染色结果显示，Sham组心肌组织排列整齐，未见炎症浸润现象；MI组心肌细胞排列紊乱，间质增多，炎症细胞浸润明显；MI+shNRON组心肌组织有显著恢复现象，少见炎症细胞浸润；MI+NC组与MI组相比并无改善，见图 1。
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| A, Sham group; B, MI group; C, MI+shNRON group; D, MI+NC group. 图 1 各组心肌组织病理变化 ×200 Fig.1 Pathological changes of myocardial tissue in each group ×200 |
2.3 各组心肌组织纤维化程度比较
Masson染色结果显示，Sham组心肌组织几乎无纤维化现象；MI组胶原沉积明显，可见大量蓝染纤维，纤维化程度严重；MI+shNRON组纤维化程度减轻，只有少量胶原沉积现象；MI+NC组仍有严重纤维化现象，见图 2。
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| A, Sham group; B, MI group; C, MI+shNRON group; D, MI+NC group. 图 2 各组心肌组织纤维化程度 ×200 Fig.2 The degree of myocardial fibrosis in each group ×200 |
2.4 各组心肌组织colⅠ的表达水平比较
免疫组织化学检测结果显示，Sham组心肌组织colⅠ的表达极少；MI组可见大量棕黄色colⅠ的阳性染色，colⅠ表达显著升高；MI+shNRON组仅有少量colⅠ阳性染色，colⅠ表达下降；MI+NC组colⅠ表达仍较高，见图 3。
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| A, Sham group; B, MI group; C, MI+shNRON group; D, MI+NC group. 图 3 各组心肌组织colⅠ的表达水平 ×200 Fig.3 The expression level of collagen TypeⅠ in myocardial tissue of each group ×200 |
2.5 各组心肌组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平比较
Western blotting结果显示，与Sham组（1.00±0.00）相比，MI组TGF-β1（1.76±0.17）、p-Smad2（1.91±0.17）、p-Smad3（1.89±0.05）蛋白的表达显著升高（P < 0.05）。与MI组相比，MI+shNRON组TGF-β1（1.24±0.13）、p-Smad2（1.39±0.09）、p-Smad3（1.54±0.05）蛋白的表达显著下降（P < 0.05）。与MI组相比，MI+NC组TGF-β1（1.81±0.40）、p-Smad2（1.98±0.11）、p-Smad3（1.90±0.09）蛋白的表达无统计学差异（P > 0.05），见图 4。
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| 1, Sham group; 2, MI group; 3, MI+shNRON group; 4, MI+NC group. 图 4 各组心肌组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平 Fig.4 The protein expression levels of TGF-β1, p-Smad2, and p-Smad3 in myocardial tissue of each group |
3 讨论
MI具有高致死率且发病迅速，可诱发心力衰竭甚至猝死。MF是MI后胶原过度沉积的结果，MI早期胶原的沉积可形成瘢痕组织从而防止心脏破裂，但过度沉积使心肌大范围纤维化，可引起心肌僵硬度增加，心肌收缩和舒张功能障碍，最终导致心力衰竭。抑制MF并减缓心室重构是治疗MI的重要策略。
lncRNA功能失调可导致癌症、心血管等多种疾病的发生。NRON被认为是NFAT的抑制因子，可以调控NFAT的去磷酸化和核转运进程 [10]。研究[11-12]发现，NRON在多种组织和细胞中表达，包括骨骼组织、血管平滑肌细胞等，通过与不同的靶点结合发挥多种功能。本课题组前期研究[9]发现敲减NRON可显著抑制MI后细胞凋亡的发生，本研究进一步探讨了NRON对MI诱导的MF的影响，与之前的MI造模时间不同，本研究选取MI后28 d检测小鼠心肌组织中NRON的表达变化，前期研究[9]已证实NRON在MI后7 d表达上调，本研究进一步证实NRON在MI后28 d表达仍显著上调，再次提示NRON可能对MI具有重要调控作用。HE染色、Masson染色、免疫组织化学检测结果显示，敲减NRON可明显缓解由MI导致的心肌排列紊乱和炎症细胞浸润现象，减轻纤维化程度并抑制colⅠ的表达。这表明NRON可有效改善心肌损伤，抑制MF的发生，提示NRON可能是治疗MF的重要靶点。
MF的发病机制尚未完全明确，研究[13]发现TGF-β是介导纤维化发生发展的关键因子。TGF-β在体内有多种亚型，其中TGF-β1是最强有力的促纤维化因子，也是心脏中主要存在的亚型。TGF-β1下游信号通路中最为经典的是Smad依赖性TGF-β1信号传导通路，在正常情况下，TGF-β1以无活性的前体形式存在，当心肌缺血缺氧时，TGF-β1迅速活化并与受体结合，促进Smad2/3蛋白磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4蛋白结合形成Smad复合物，并转移至细胞核，诱导纤维化相关基因的表达，促进胶原蛋白沉积，发挥促纤维化的作用[14]。已有研究[15]报道，lncRNA是影响TGF-β/Smad信号转导的重要调节因子，TANG等[16]鉴定出lncRNA GAS5是一种由TGF-β诱导的成纤维细胞活化的调节因子。GAS5直接结合Smad3，并加速Smad3的去磷酸化，抑制TGF-β/Smad信号通路。本研究结果显示，特异性敲减NRON可显著逆转由MI导致的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白的病理性增高，提示敲减NRON可能通过影响TGF-β/Smad信号通路，发挥抑制MF的作用。
综上所述，NRON参与MI后MF的发生发展，敲低NRON可显著缓解心肌组织病理损伤，减轻纤维化程度并延缓心室重构，具体机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路相关。本研究为lncRNA在MF中的作用提供了新的证据。
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