临床多种常见代谢疾病（如动脉粥样硬化、脂肪肝、糖尿病等）均与脂质代谢障碍关系密切，因此通过调控脂质代谢障碍防治代谢疾病尤为重要^[1]。脂质代谢有多种途径，最主要的分解途径是通过线粒体β氧化将脂肪酸彻底水解。当摄入过多油脂时，体内脂质含量异常增加，分解、消化、吸收、转运出现异常，血液和组织器官中脂质含量失衡，从而影响身体机能，脂质堆积体内，而脂质代谢异常可进一步发展为动脉粥样硬化等疾病^[2]。

中医认为，脂质沉积本质是脏腑功能失调，导致阴阳气血失衡，痰湿、淤血等病理产物堆积，阻滞经络气血运行。《黄帝内经》中记载：“肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”^[3]，“嗜食肥甘厚味”导致脾家伤，脾家伤则运化失司，痰饮水湿郁于中焦则出现脘腹胀满等症状，郁而化久则生热。治则上以疏肝健脾为主，疏肝以促进脂质代谢，健脾以祛除湿浊，同时兼顾活血化瘀以通络。《中华人民共和国药典》中记载，丹蒌片由瓜蒌皮、薤白、川芎等十味中药组成，具有化痰散结、活血化瘀的功效，此方是目前临床用于治疗痰瘀互结导致胸痹的常见药。现代研究^[4]表明，丹蒌片可以降低总胆固醇、甘油三酯（triglyceride，TG）水平，抑制动脉粥样硬化斑块形成，并通过调控炎症小体抑制炎症反应和氧化应激反应等。但丹蒌片改善脂质代谢的机制并未阐明。本课题组前期研究^[5]发现，丹蒌片可能通过干预氧化应激反应调控脂质代谢。本研究采用油酸诱导HepG2细胞建立脂质沉积模型，探究丹蒌片改善脂质沉积的作用机制，为临床治疗脂质沉积提供依据。

1 材料与方法 1.1 细胞系、主要试剂和仪器

HepG2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。p53激动剂，购自美国MedChemExpress公司；丹蒌片，购自吉林康乃尔药业有限公司；TG、非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司；总超氧化物歧化酶比色法测试盒、氧化应激指标丙二醛（malondialdehyde，MDA）比色法测试盒、活性氧（reative oxygen species，ROS）荧光法测试盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）测定试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。酶标仪，购自上海普迈生物科技有限公司；高速冷冻离心机，购自美国ThermoFisher Scientific公司；荧光细胞成像仪，购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 确定含丹蒌片血清最佳给药浓度和时间

大鼠适应性喂养1周，随机分为空白对照组和丹蒌片组，每组6只。按照表面积换算法计算给药量，丹蒌片组用丹蒌片水溶液（680 mg/kg）灌胃，40.3 mg/次，空白对照组等体积生理盐水灌胃，2次/d，连续灌胃7 d。末次给药2 h后，腹主动脉采血，室温静置1 h，3 000 r/min离心10 min。收集血清，进行过滤灭活处理，于-20 ℃冰箱保存。将含丹蒌片血清用培养基稀释，配制成含丹蒌片血清体积分数分别为5%、10%、15%、20%的培养液。用0%（空白对照）、5%、10%、15%、20%含丹蒌片血清培养液分别培养HepG2细胞12、24和48 h。采用CCK-8试剂盒计算细胞活性，筛选出丹蒌片最佳给药浓度和给药时间。

1.2.2 不同浓度油酸对HepG2细胞活性影响：取对数

期HepG2细胞，接种于96孔板中，待细胞培养贴壁后，用含0（空白对照）、100、200、400、800、1 000 μmol/L油酸的新鲜培养液继续培养细胞，再加入CCK-8溶液继续培养2 h，通过酶标仪检测各孔光密度（optical density，OD）值，计算细胞活性，确定最佳油酸浓度，构建脂质沉积模型^[6]。

1.2.3 细胞处理和分组

将HepG2细胞分为空白对照组（不做处理）、模型组（给予油酸）、丹蒌片组（给予油酸+含丹蒌片血清），用于后续实验。分组处理所用的含丹蒌片血清和油酸的浓度，为1.2.1和1.2.2中确定的最佳浓度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞上清液NEFA和TG的含量

取各组细胞上清液，按照试剂盒说明书进行检测，于酶标仪上读取各孔OD值，计算各组细胞中NEFA和TG含量。

1.2.5 油红O染色观察脂滴分布情况

取对数期细胞，接种于6孔板，每孔2 mL，待细胞贴壁后培养24 h，按照说明书操作，封片后，光学显微镜下观察脂滴分布情况。

1.2.6 细胞内SOD、MDA、CAT及COX-2含量测定

吸取各组细胞培养液，4 000 r/min离心5 min，取上清液待测。按照ELISA试剂盒说明书操作，于酶标仪上读取各孔OD值，计算各组细胞中SOD、MDA、CAT和COX-2含量。

1.2.7 DCFH-DA荧光探针测定ROS表达

取对数期细胞，接种于6孔板，培养好的细胞用PBS洗涤3次，加入DMEM培养基，根据说明书配置工作液，加入DCFH-DA探针，室温下避光孵育30 min，PBS再次洗涤3次，去除探针，荧光显微镜下观察细胞并拍照。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。数据用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同浓度丹蒌片及不同给药时间对HepG2细胞活性的影响

与对照组相比，15%和20%丹蒌片组在12、24、48 h时细胞活性明显降低（均P < 0.01），10%丹蒌片组在48 h时细胞活性明显降低（P < 0.01），在12和24 h时细胞活性无统计学差异（均P > 0.05）。见表 1。因此，本研究确定的丹蒌片最佳给药浓度是10%，给药时间是24 h。

2.2 不同浓度油酸对HepG2细胞活性的影响

对照组以及100、200、400、800、1 000 μmol/L油酸组细胞活性分别为（100.00±4.49）%、（97.68±6.96）%、（93.12±5.89）%、（85.66±8.81）%、（85.88±7.01）%、（49.77±7.78）%。与对照组相比，100和200 μmol/L油酸组细胞活性无明显变化（均P > 0.05），400、800和1 000 μmol/L油酸组细胞活性明显降低（分别为P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01）。因此，本研究确定的最佳油酸浓度为800 μmol/L。

2.3 丹蒌片调控HepG2细胞中NEFA和TG水平

空白对照组、模型组、丹蒌片组HepG2细胞中NEFA水平分别为（0.009±0.003）、（0.285±0.025）、（0.213±0.014）mmol/L，TG水平分别为（0.081±0.031）、（0.398±0.046）、（0.171±0.017）mmol/L。与空白对照组相比，模型组HepG2细胞中NEFA和TG水平明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，丹蒌片组NEFA和TG水平明显降低（P < 0.01）。

2.4 丹蒌片调控HepG2细胞脂质水平

与空白对照组相比，模型组HepG2细胞中红染明显，脂滴数量较多；与模型组相比，丹蒌片组HepG2细胞中脂质红染情况改善，脂滴体积明显缩小。见图 1。

2.5 丹蒌片对HepG2细胞氧化应激的影响

与空白对照组相比，模型组MDA和COX-2水平明显升高，CAT和SOD水平明显降低（P < 0.05）；与模型组相比，丹蒌片组MDA和COX-2水平明显降低，CAT和SOD水平明显升高（P < 0.05）。见表 2。

2.6 丹蒌片对ROS表达的影响

与空白对照组相比，模型组ROS荧光强度明显增强（P < 0.01）；与模型组相比，丹蒌片组ROS荧光强度明显减弱（P < 0.01）。见图 2、表 2。

3 讨论

流行病学调查显示，全球约30%的成年人存在脂质沉积，且脂质沉积有年轻化的趋势^[7]。脂质沉积的核心机制是肝脏脂质代谢失衡，胰岛素抵抗促使外周脂肪组织分解增加，释放过量NEFA进入肝脏，同时肝细胞自身合成TG增多，而极低密度脂蛋白分泌不足，导致脂质在肝细胞内堆积^[8]。此外，ROS过度生成引发氧化应激，促使肝细胞脂质过氧化，激活炎症通路，导致肝细胞损伤和脂肪变性，从而进一步加重脂质沉积^[9]。油酸作为重要的游离脂肪酸，能够通过直接诱导脂质沉积、引发氧化应激及调控脂质代谢相关基因表达，扰乱脂质代谢平衡，从而建立脂质沉积模型^[6]。因此，本研究采用油酸刺激HepG2细胞，建立脂质沉积细胞模型。

本研究发现，当油酸浓度达到400和800 μmol/L时，细胞活性下降，但细胞存活率仍在80%以上；但当油酸浓度达到1 000 μmol/L时，细胞活性显著降低，细胞死亡率超50%。因此，本研究后续实验选用800 μmol/L油酸作为最佳造模浓度。ELISA和油红O染色结果证明，模型组NEFA和TG含量明显高于空白对照组，提示油酸诱导脂质沉积细胞模型成功建立。

中医治疗脂质沉积以健脾化痰祛瘀法为主。《中华人民共和国药典》中记载，丹蒌片用于治疗痰瘀互结型冠状动脉粥样硬化性心脏病，方中诸药配伍通过“化痰-祛瘀-补气-调气机”的立体配伍，实现标本兼治。根据中医“未病先防”的观念，本课题组前期做了多项相关实验，探究丹蒌片在治疗脂质代谢方面的功效及其机制。本课题组前期研究发现，丹蒌片可以减轻非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝脏氧化损伤^[10-11]；可以影响TG合成，改善ApoE^-/-AS小鼠肝脏脂质沉积^[12]；亦可介导线粒体损伤，改善高脂喂养的ApoE^-/-小鼠脂质代谢水平^{[5, 13]}。本研究通过CCK-8法检测不同浓度含丹蒌片血清对细胞活性的影响，发现丹蒌片给药浓度为15%时，细胞活性明显降低，因此选取10%含丹蒌片血清用于后续实验。本研究结果表明，丹蒌片可明显降低油酸导致的NEFA和TG水平升高，且油红O染色结果显示，与模型组相比，丹蒌片组脂滴体积缩小且脂滴数量减少，提示丹蒌片可以有效改善脂质沉积情况。

氧化应激与脂质沉积是一个双向恶性循环，脂质沉积可导致线粒体膜脂质过氧化，破坏电子传递链功能，引发“电子泄漏”，释放大量ROS，同时肝脏脂滴沉积会抑制线粒体脂肪酸氧化能力，迫使细胞依赖效率较低的过氧化物酶体β氧化途径，进一步加剧ROS^[14-15]。而大量ROS可攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，生成MDA等毒性产物，破坏线粒体功能，抑制脂肪酸β氧化，导致NEFA和TG在体内异常堆积。本研究结果表明，模型组MDA和COX-2水平明显升高，抗氧化酶SOD和CAT水平明显降低，丹蒌片干预后抗氧化酶呈高表达，而MDA和COX-2表达水平降低。本研究中，DCFH-DA荧光探针法检测结果表明，模型组ROS呈高表达，丹蒌片组ROS含量明显降低，证实丹蒌片可能通过影响氧化应激反应调控脂质代谢。

综上所述，丹蒌片通过抑制氧化应激反应，促进脂质代谢，从而改善油酸诱导的HepG2高脂细胞模型脂质沉积情况。