2025, Vol. 54文章信息
- 刘星池, 张倩, 李栗妍, 关小川, 张宁, 于月新
- LIU Xingchi, ZHANG Qian, LI Liyan, GUAN Xiaochuan, ZHANG Ning, YU Yuexin
- 精浆氧化还原电位与精子DNA碎片指数、高DNA着色性及运动参数的相关性研究
- Relationship between seminal plasma oxidation-reduction potential and sperm DNA fragmentation index, high DNA staining, and motility parameters
- 中国医科大学学报, 2025, 54(1): 56-60
- Journal of China Medical University, 2025, 54(1): 56-60
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文章历史
- 收稿日期：2024-04-03
- 网络出版时间：2025-01-09 15:40:01
引用本文 |
2. 中国医科大学公共卫生学院卫生统计学教研室, 沈阳 110122
2. Department of Health Statistics, School of Public Health, China Medical University, Shenyang 110122, China
据世界卫生组织估计，全球约有1.9亿人患有不孕（育）症[1]。约50%的不孕（育）症是部分或全部归因于男性因素[2]。氧化应激（oxidative stress，OS）在男性不育症的病因学中起着重要作用[3-4]，准确评估OS对于男性不育症的临床诊断和治疗非常重要。目前OS的检测方法包括对氧化剂、抗氧化剂、事后损伤[如丙二醛、精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）] 的检测，这些检测结果并不相互关联，只能提供单一的OS指标[5-6]。而精浆氧化还原电位（oxidation reduction potential，ORP）是衡量氧化剂和抗氧化剂/还原剂之间总体平衡的指标[7]。本研究采用检测精浆ORP的方法检测OS，并对精浆归一化氧化还原电位（normalization oxidation-reduction potential，nORP）与精子DNA碎片化及精子运动参数的相关性进行研究，探讨nORP能否作为评估男性生育潜能的生物标志物。
1 材料与方法 1.1 研究对象选取2023年10月至12月于中国人民解放军北部战区总医院生殖医学科男科门诊就诊的309例男性作为研究对象。纳入标准：禁欲2~7 d；精子浓度≥5×106/mL；有活动精子。排除标准：已确诊重度少精症、无精症；白细胞精子症；精液液化障碍及黏稠度异常。根据nORP进行三等分，≤4.00 mV/（106·mL-1）为低值组（n=102），> 4.00~ < 9.08 mV/（106·mL-1）为中间组（n=103），≥9.08 mV/（106·mL-1）为高值组（n=104）。本研究获得中国人民解放军北部战区总医院医学伦理委员会批准[伦审（2024）1号]。所有研究对象知情同意。
1.2 研究方法 1.2.1 精液标本采集通过手淫法收集精液，置于37 ℃恒温水浴箱中，待精液彻底液化进行检测。
1.2.2 精子运动参数检测采用IVOSⅡ全自动精子质量分析仪（美国Hamilton Thorne公司）检测精液，获取精子运动参数，包括精液量、精子总数、精子浓度、前向运动精子数、前向运动精子百分率、非前向精子数、非前向精子百分率、不动精子数、不动精子百分率、精子活动率、曲线速度（curvilinear velocity，VCL）、直线速度（straight line velocity，VSL）、平均速度（average path velocity，VAP）、线性指数（linearity index，LIN）、直性指数（straightness index，STR）及振动指数（wobble index，WOB）。所有检测操作严格按照世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》 [8]的标准进行。
1.2.3 精子DFI及高DNA着色性（high DNA staining，HDS）检测采用C5型流式细胞仪（美国BD公司）及精子DNA完整性诊断试剂盒（浙江星博生物科技股份有限公司），按照精子染色质结构测定法检测研究对象的精子DFI和HDS水平。
1.2.4 精浆ORP检测将精液以4 000 r/min、10 cm有效半径离心15 min，留取精浆后使用YHBJ-262型便携式ORP计（上海仪电科学仪器股份有限公司）检测精浆ORP水平，然后将ORP数据除以精子浓度以控制精子数量的差异，获得的数值为nORP，报告单位为mV/（106·mL-1）。ORP为正时表明氧化作用强于还原作用，ORP为负时表明还原作用强于氧化作用。ORP越大，氧化和还原之间的不平衡就越大。
1.3 统计学分析采用R 4.3.2软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25~P75）表示，组间比较采用非参数检验。P < 0.05为差异有统计学意义。采用Pearson或Spearman相关性检验分析ORP、nORP与各指标的相关性。采用广义线性回归方法探讨nORP与HDS的关系，同时生成HDS与nORP的平滑曲线拟合。
2 结果 2.1 一般临床资料及精子运动参数特征本研究纳入的309例男性平均年龄为31（28~34）岁、禁欲时间为4（3~5）d、精液量3.68（2.95~4.59）mL、精子总数92.15×106（49.63×106~158.79×106）、精子浓度25.90×106/mL（13.45×106/mL~44.14×106/mL）、前向运动精子数46.73×106（22.40×106~80.17×106）、前向运动精子百分率53.00%（39.00%~63.00%）、非前向精子数7.32×106（3.43×106~15.76×106）、非前向精子百分率8.00%（6.00%~11.00%）、不动精子数33.68×106（18.54×106~56.47×106）、不动精子百分率38.00%（28.00%~50.00%）、总活动率62.00%（50.00%~72.00%）、VCL（66.31±15.25）μm/s、VSL 33.14（28.39~36.27）μm/s、VAP（41.43±8.05）μm/s、LIN 52.03±7.33、STR 80.36（76.39~84.30）、WOB 64.80（61.85~67.58）、DFI 7.14%（4.50%~10.42%）、HDS 7.08%（5.59%~9.21%）、ORP（156.44±16.49）mV、nORP 5.94（3.62~11.42）mV/（106·mL-1）。根据nORP进行三等分，精液量、精子总数、精子浓度、前向运动精子数、前向运动精子百分率、非前向精子数、非前向精子数百分率、不动精子数、不动精子百分率、精子活动率、VCL、VSL、VAP、LIN组间比较差异有统计学意义（P < 0.05），见表 1。
| Index | Total(n=309) | Low nORP(n=102) | Middle nORP(n=103) | High nORP(n=104) | P |
| Age(year) | 31.00(28.00-34.00) | 30.50(27.25-33.75) | 31.00(27.50-34.00) | 31.00(28.75-34.00) | 0.782 |
| Days of abstinence(d) | 4.00(3.00-5.00) | 4.00(3.00-5.00) | 4.00(3.00-5.00) | 4.00(3.00-5.00) | 0.887 |
| Semen volume(mL) | 3.68(2.95-4.59) | 3.33(2.68-4.38) | 3.91(2.92-4.56) | 3.73(3.15-4.90) | 0.009 |
| Total sperm count(×106) | 92.15(49.63-158.79) | 178.01(133.92-221.50) | 94.92(74.95-125.37) | 39.01(27.04-56.59) | < 0.001 |
| Sperm concentration(×106/mL) | 25.90(13.45-44.14) | 50.66(44.17-62.73) | 25.90(21.82-31.80) | 10.31(7.37-13.45) | < 0.001 |
| Forward motile sperm count(×106) | 46.73(22.40-80.17) | 90.34(65.69-138.33) | 51.83(33.88-66.73) | 14.93(10.34-4.53) | < 0.001 |
| Forward motile sperm percentage(%) | 53.00(39.00-63.00) | 57.00(43.00-66.75) | 56.00(45.00-64.50) | 46.50(30.00-5.00) | < 0.001 |
| Non-forward sperm count(×106) | 7.32(3.43-15.76) | 16.84(12.48-23.37) | 7.99(5.22-13.75) | 2.56(1.57-4.29) | < 0.001 |
| Non-forward percentage(%) | 8.00(6.00-11.00) | 10.00(8.00-12.00) | 9.00(7.00-11.00) | 7.00(5.00-9.00) | < 0.001 |
| Immotile sperm count(×106) | 33.68(18.54-56.47) | 60.27(37.39-86.27) | 36.19(22.13-51.30) | 18.21(12.03-28.24) | < 0.001 |
| Immotile sperm percentage(%) | 38.00(28.00-50.00) | 31.00(24.00-44.75) | 34.00(25.50-45.50) | 44.00(38.00-64.00) | < 0.001 |
| Sperm motility rate(%) | 62.00(50.00-72.00) | 69.00(55.25-76.00) | 66.00(54.50-74.50) | 56.00(36.00-62.00) | < 0.001 |
| VCL(μm/s) | 66.31±15.25 | 70.34±14.32 | 67.43±14.91 | 61.24±15.19 | < 0.001 |
| VSL(μm/s) | 33.14(28.39-36.27) | 34.39(30.10-37.53) | 33.48(29.45-36.34) | 31.04(26.90-35.05) | < 0.001 |
| VAP(μm/s) | 41.43±8.05 | 43.82±7.79 | 42.00±7.67 | 38.51±7.84 | < 0.001 |
| LIN | 52.03±7.33 | 51.70±6.19 | 52.01±6.41 | 52.37±9.06 | 0.392 |
| STR | 80.36(76.39-84.30) | 78.94(76.12-82.87) | 80.54(76.75-83.80) | 81.28(76.89-85.86) | 0.072 |
| WOB | 64.80(61.85-67.58) | 64.38(62.06-67.51) | 64.82(61.16-67.16) | 64.99(62.21-68.29) | 0.538 |
| DFI(%) | 7.14(4.50-10.42) | 6.49(4.25-9.75) | 7.18(4.35-10.25) | 7.88(5.37-11.27) | 0.068 |
| HDS(%) | 7.08(5.59-9.21) | 6.07(4.72-8.14) | 6.90(5.70-8.44) | 8.16(6.56-11.09) | < 0.001 |
| ORP(mV) | 156.44±16.49 | 153.33±15.00 | 155.00±14.68 | 160.88±16.68 | 0.003 |
| Low nORP，≤4.00 mV/（106·mL-1）；middle nORP，> 4.00 to < 9.08 mV/（106·mL-1）；high nORP，≥9.08 mV/（106·mL-1）. | |||||
2.2 ORP与精子DFI、HDS及运动参数的相关性
Pearson相关性分析及Spearman相关性分析结果表明，ORP和nORP均与精液量、不动精子百分率及DFI呈正相关，与前向运动精子数、前向运动精子百分率、精子活动率、VSL、VAP呈负相关（P < 0.05）；另外，ORP还与禁欲时间、不动精子数呈正相关（P < 0.05），LIN、STR及WOB呈负相关（P < 0.05），而nORP还与HDS呈正相关（P < 0.05），精子总数、精子浓度、非前向精子数、非前向精子百分率、不动精子数、VCL呈负相关（P < 0.05）。见表 2。
| Index | ORP | nORP | |||
| r | P | r | P | ||
| Age | 0.017 0 | 0.766 | 0.031 4 | 0.582 | |
| Days of abstinence | 0.244 0 | < 0.001 | 0.005 9 | 0.918 | |
| Semen volume | 0.181 6 | 0.001 | 0.169 3 | 0.003 | |
| Total sperm count | -0.022 1 | 0.698 | -0.869 9 | < 0.001 | |
| Sperm concentration | -0.106 7 | 0.061 | -0.991 2 | < 0.001 | |
| Forward motile sperm count | -0.117 8 | 0.039 | -0.825 8 | < 0.001 | |
| Forward motile sperm percentage | -0.256 6 | < 0.001 | -0.265 3 | < 0.001 | |
| Non-forward sperm count | -0.034 9 | 0.541 | -0.828 3 | < 0.001 | |
| Non-forward sperm percentage | -0.037 0 | 0.517 | -0.323 0 | < 0.001 | |
| Immotile sperm count | 0.112 9 | 0.047 | -0.654 2 | < 0.001 | |
| Immotile sperm percentage | 0.253 5 | < 0.001 | 0.345 1 | < 0.001 | |
| Sperm motility rate | -0.253 3 | < 0.001 | -0.344 5 | < 0.001 | |
| VCL | -0.093 8 | 0.100 | -0.265 1 | < 0.001 | |
| VSL | -0.114 9 | 0.044 | -0.245 8 | < 0.001 | |
| VAP | -0.136 4 | 0.017 | -0.289 3 | < 0.001 | |
| LIN | -0.232 2 | < 0.001 | 0.064 9 | 0.256 | |
| STR | -0.170 2 | 0.003 | 0.111 4 | 0.050 | |
| WOB | -0.157 6 | 0.006 | 0.049 2 | 0.389 | |
| DFI | 0.286 7 | < 0.001 | 0.128 6 | 0.024 | |
| HDS | 0.066 5 | 0.244 | 0.338 1 | < 0.001 | |
2.3 nORP与HDS的关系
采用广义线性回归方法探讨nORP与HDS的关系，并制作nORP与HDS的平滑曲线拟合，中间线表示变量之间的平滑曲线，两侧线代表 95%CI的上限和下限。对年龄及禁欲时间进行了调整，随着HDS的增加，nORP呈线性上升趋势，见图 1。另外，使用2种模型（未调整模型及部分调整模型）评估nORP与HDS之间的关联性。在未调整模型中，nORP与HDS呈正相关（β=0.14，95%CI：0.09~0.19，P < 0.05）。在部分调整模型（调整年龄、禁欲时间、精液量）中，nORP与HDS呈正相关（β=0.15，95%CI：0.10~0.19，P < 0.05）。模型调整前后结果无明显差异。
|
| 图 1 HDS与nORP的关系（曲线拟合） Fig.1 Relationship between HDS and nORP(curve fitting) |
3 讨论
特发性不育症的可能原因之一是精液、精浆或精子中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增加所致的OS。全球男性不育症中半数以上是由于OS导致[9]。精子因其有限的抗氧化系统，对ROS的损伤作用非常敏感[10]。有限的抗氧化反应导致精液中多不饱和脂肪酸被氧化，脂质过氧化水平增加[11]。此外，精子的DNA修复系统有限。精液中含有不同成熟度的精子、白细胞、上皮细胞和生精过程中形成的圆形细胞[12]，ROS主要由白细胞、形态异常的精子或未成熟精子产生[13]。本研究发现，精子活动率、DFI，尤其是HDS，与nORP呈强相关性，且随着HDS增加，nORP呈线性上升趋势。目前，国内直接证明OS与精子活力异常之间关系的研究较少。因此，评价男性精液中ROS、OS水平对预测精子活力异常及OS不育的风险具有重要的临床意义。
快速、准确检测ROS或评价男性精液OS是临床中需要解决的关键技术问题。目前临床中已有的直接、间接检测OS的方法的重点均是评估ROS的形成、脂质过氧化产物和总抗氧化能力[14]。ORP作为一种评估OS的新方法，可反映精液中氧化相关分子和抗氧化相关分子的比率。有研究[15]通过Mioxsys系统测试ORP并进行评估，该测试使用低电压还原电流测量从抗氧化剂到氧化剂的电子转移，获得的数据反映精液样本中所有氧化剂和抗氧化剂活性的相对值，高水平ORP表明氧化剂的活性相对增加，可通过小体积精液样本反映男性精液高水平OS。ORP测定被认为是最快的、患者接受程度最高的OS检测方法，且不需要检测人员具备特殊的专业知识，可快速应用于临床[16]。我院生殖实验室在国内首先采用精浆ORP电极方法检测OS，与Mioxsys系统不同，该方法通过收集1 mL精液并离心取精浆测量ORP。本研究中，将nORP分组后发现，低nORP组、中间nORP组、高nORP组的前向运动精子百分率、非前向精子百分率、精子活动率、VCL、VSL及VAP依次降低，而不动精子百分率依次升高，且组间差异均有统计学意义（P < 0.05），与既往研究[17]结果一致，提示nORP同样能反映男性精液的OS水平。另外，本研究采用的nORP检测成本更低、操作更简便，因此更具有临床推广价值。
本研究的不足之处为纳入研究的样本量有限，且为单中心研究。后期将通过扩大样本量进行男性群体的分层分析，以提高结果的可信度和适用性。
综上所述，本研究通过对精液样本的ORP、nORP、DFI、HDS及常规数据分析，发现ORP、nORP均与DFI和主要运动参数相关，且nORP还与代表精子成熟度的HDS相关，更能反映精液质量，可作为评估男性生育潜能的生物标志物。
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