2025, Vol. 54文章信息
- 满超, 王岩松
- MAN Chao, WANG Yansong
- 淫羊藿苷对糖尿病大鼠骨质疏松症的作用及其机制
- Effects and mechanism on icariin for osteoporosis in diabetic rats
- 中国医科大学学报, 2025, 54(1): 12-17, 23
- Journal of China Medical University, 2025, 54(1): 12-17, 23
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文章历史
- 收稿日期：2023-12-06
- 网络出版时间：2025-01-09 15:02:26
引用本文 |
2. 锦州医科大学附属第一医院骨外科, 辽宁 锦州 121001
2. Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
研究[1-3]显示，糖尿病(diabetes mellitus，DM) 发病率逐年增高，糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP) 是DM的并发症之一。DM患者由于受损的骨量和骨外因素导致骨折风险增加[4-5]，而具体作用机制尚未明确。目前DOP尚无有效的治疗方法。雌激素受体(estrogen receptor，ER) 属于核内受体，和其他的类固醇激素受体相似，有雌激素结合域、DNA结合域及转录激活域，属于转录因子核受体超家族成员[6]。研究[7]显示，基因多态性与绝经后骨质疏松症有关，但ER1在DOP中的作用机制尚不清楚。
淫羊藿苷是从淫羊藿属植物中分离出的活性成分。淫羊藿苷已被用于骨折和骨质疏松症的防治研究[8]。研究[9]表明，体内淫羊藿苷处理显著降低了链脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 诱导Wistar大鼠的骨吸收；在体外以剂量依赖方式抑制高糖诱导的大鼠破骨细胞生成。淫羊藿苷能够促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化，激活Runx2启动子和Wnt/β-catenin通路对成骨细胞分化[10]。然而，淫羊藿苷对DOP的保护作用尚不清楚。本研究探讨淫羊藿苷对DOP的作用及其机制，旨在为DOP的防治提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物50只SPF级6周龄雄性SD大鼠，体重(220±20) g，购自锦州医科大学实验动物中心，许可证编号为SYXK [辽] 2019-0007。将大鼠置于22~24 ℃、湿度55%~60%环境中饲养，12 h光/12 h暗循环，自由取食、饮水，适应性培养1周后进行实验。本研究获得锦州医科大学实验动物伦理委员会批准(20220622198)。
1.2 主要试剂和仪器STZ购自美国Sigma公司，淫羊藿苷购自中国Selleck公司，ER1、PDE5A和β-cantenin抗体购自英国abcam公司，Wnt抗体购自中国Proteintech公司，HE试剂盒和Western blotting二抗购自中国Solarbio公司，RIPA裂解液、BCA试剂盒购自中国Beyotime公司，ELISA试剂盒购自中国MLBIO公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司，水平电泳仪购自美国BIO-RAD公司。
1.3 方法 1.3.1 DM大鼠骨质疏松症模型的建立及分组大鼠饲养1周后，禁食水2 h，采用单次腹腔注射STZ (50 mg/kg) 制备DM模型。72 h后血糖≥16.7 mmol/L为DM模型建立成功。
大鼠随机分为5组：对照组(Control组，无任何处理)、STZ组(构建DM大鼠模型)、低剂量淫羊藿苷组[DM模型大鼠构建成功4周后，50 mg/ (kg·d) 淫羊藿苷灌胃，连续8周]、高剂量淫羊藿苷组[DM大鼠模型构建成功4周后，100 mg/ (kg·d) 淫羊藿苷灌胃，连续8周[4]]、高剂量淫羊藿苷+ER1-siRNA组[DM大鼠模型构建成功4周后，100 mg/ (kg·d) 淫羊藿苷灌胃，连续8周；10 μL ER1-siRNA尾静脉注射，1次/4周，共2次]，每组10只。给药8周后取材用于后续实验。
1.3.2 siRNA设计及构建利用美国Invitrogen公司siRNA软件设计大鼠ER1 mRNA的siRNA，靶向特异性干扰片段ER1-siRNA和si-RNA阴性对照(si-NC) 干扰片段由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。ER1-siRNA引物序列见表 1。
| Gene | Primer sequence |
| ER1-siRNA | 5’-GAGGGAGAAUGUUGAAACATT-3’ |
| 5’-UGUUUCAACAUUCUCCCUCTT-3’ | |
| ER1-siRNA-NC | 5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3’ |
| 5’-UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3’ |
1.3.3 股骨组织病理形态学检测
各组大鼠股骨组织石蜡切片脱水后PBS清洗3遍，苏木素染色5 min。分化30 s后伊红染色2 min，然后清洗5 min。乙醇和二甲苯溶液脱水透明，中性树胶封片。
1.3.4 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 检测血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP) 水平和血钙浓度各组大鼠心脏取血，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上层清澈血清，按照ELISA试剂盒说明书操作，10 μL标准品、阴性对照、阳性对照和待测样本加入孔板，加液后37 ℃水浴60 min。A液B液混匀后反应15 min，然后加终止液检测吸光度(optical density，OD)值。
1.3.5 淫羊藿苷蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI) 网络分析及核心靶点预测利用STITCH数据库(http://stitch.embl.de/ )，以“Homo sapiens”为物种划分，筛选出淫羊藿苷可能的作用靶点，分析核心靶点的相互作用关系。
1.3.6 分子对接验证淫羊藿苷三维结构来源于PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，结合PDB数据库(https://www.rcsb.org/) 中核心靶点的蛋白质结构，利用Autodock Vina对淫羊藿苷与核心靶点进行分子对接验证；同时验证淫羊藿苷对相关蛋白表达的影响。
1.3.7 免疫组织化学检测大鼠股骨组织中ER1表达石蜡切片脱蜡至水后，高压修复2 min。恢复室温后3% H2O2避光反应10 min，PBS清洗，封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜。次日二抗孵育1 h，PBS清洗，DAB显色并苏木素复染，梯度乙醇和二甲苯脱水透明，中性树胶封片，晾干后在倒置荧光显微镜下观察。
1.3.8 Western blotting检测大鼠股骨组织中ER1、PDE5A、Wnt和β-cantenin蛋白表达各组取新鲜股骨组织加入裂解液，超声破碎仪打碎后收集上清，于4 ℃、12 000 r/min离心25 min，提取上清液。使用BCA试剂盒检测蛋白含量，根据蛋白含量配置分离胶、浓缩胶，制备SDS-PAGE凝胶。加样后80 V 30 min电泳，然后改为120 V 60 min电泳，电泳结束后按照0.25 A 90 min进行转膜。转膜结束后用TBST配制5%脱脂牛奶封闭2 h。按照抗ER1抗体(1∶1 000)、抗PDE5A抗体(1∶2 000)、抗Wnt抗体(1∶1 000)、抗β-cantenin抗体(1∶4 000) 和内参GAPDH (1∶4 000) 稀释一抗，并将PVDF膜按照目标分子量裁切后分别放入对应抗体中，4 ℃孵育过夜。二抗(1∶4 000) 室温孵育2 h，ECL显影，然后利用ImageJ软件进行分析。
1.4 统计学分析利用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；方差齐时采用SNK-q检验，方差不齐时采用Games-Howell法进行两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠血糖和体重比较结果显示，与Control组比较，STZ组大鼠血糖升高，体重降低(均P < 0.01)。与STZ组比较，低剂量、高剂量淫羊藿苷组大鼠血糖降低(P < 0.01)，但体重比较差异无统计学意义(P > 0.05)，见表 2。
| Group | n | Blood glucose (mmol/L) | Body weight (g) | |||
| Before STZ administration | 12 weeks after STZ administration | Before STZ administration | 12 weeks after STZ administration | |||
| Control group | 5 | 4.67±0.30 | 4.75±0.39 | 212.00±12.85 | 364.80±9.05 | |
| STZ group | 5 | 4.58±0.39 | 26.16±2.381) | 200.20±13.70 | 304.40±21.531) | |
| Low-dose icariin group | 5 | 4.53±0.37 | 23.38±1.942) | 216.60±8.14 | 291.80±13.00 | |
| High-dose icariin group | 5 | 4.72±0.34 | 20.73±2.182) | 206.50±18.88 | 295.50±25.01 | |
| 1) P < 0.01 vs. control group；2) P < 0.01 vs. STZ group. | ||||||
2.2 各组大鼠股骨组织HE染色结果比较
结果显示，Control组大鼠骨膜下及股骨组织表面分布扁平成骨细胞，软骨下区骨小梁稍厚、交织成网，成骨细胞分布均匀。与Control组比较，STZ组大鼠股骨表面成骨细胞显著减少，骨细胞扁平，软骨下区骨细胞核固缩，空骨陷窝明显增多。与STZ组比较，低剂量、高剂量淫羊藿苷组骨小梁增厚、部分交织成网，成骨细胞分布较均匀，见图 1。
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| A，Control group；B，STZ group；C，low-dose icariin group；D，high-dose icariin group. 图 1 各组大鼠股骨组织病理形态学改变HE×200 Fig.1 The pathological morphology of femoral tissue of rats in each group HE×200 |
2.3 各组大鼠血清ALP、TRAP水平和血钙浓度比较
与Control组比较，STZ组大鼠ALP水平和血钙浓度下降，TRAP水平升高(均P < 0.01)。与STZ组比较，低剂量、高剂量淫羊藿苷组大鼠ALP水平和血钙浓度升高，TRAP水平降低(均P < 0.01)，见表 3。
| Group | n | Serum ALP | Serum TRAP | Blood calcium concentration |
| Control group | 5 | 2 952.75±22.45 | 53.73±1.94 | 1.22±0.07 |
| STZ group | 5 | 2 458.49±15.661) | 74.21±1.381) | 0.85±0.011) |
| Low-dose icariin group | 5 | 2 647.49±9.952) | 67.07±1.012) | 0.93±0.022) |
| High-dose icariin group | 5 | 2 864.31±7.082) | 57.64±0.802) | 1.04±0.022) |
| 1) P < 0.01 vs. Control group；2) P < 0.01 vs. STZ group. | ||||
2.4 淫羊藿苷治疗DOP核心靶点的筛选及分子对接验证
PPI网络分析筛选出淫羊藿苷相关的2个核心靶点：ER1和PDE5A，见图 2。Western blotting检测验证淫羊藿苷对ER1和PDE5A表达的影响。结果显示，与对照组比较，STZ组ER1和PDE5A表达降低(P < 0.01)；与STZ组比较，高剂量淫羊藿苷组ER1表达上调(P < 0.01)，而PDE5A表达的差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 3、表 4。分子对接验证结果显示，淫羊藿苷可以通过GLU-523、ASN-519、GLU-385、SER-456、HIS-516、TYR-459、SER-512、ASN-455和LEU-511氨基酸残基稳定结合到ER1蛋白结构上，表明ER1可能是淫羊藿苷在DOP中的潜在靶点，见图 4。
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| 图 2 淫羊藿苷的PPI网络分析 Fig.2 PPI network analysis of icariin |
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| 1，control group；2，STZ group；3，high-dose icariin group. 图 3 各组大鼠ER1和PDE5A蛋白表达 Fig.3 Protein expression of ER1 and PDE5A in rats in each group |
| Group | n | ER1 protein | PDE5A protein |
| Control group | 3 | 83.14±1.66 | 114.22±3.46 |
| STZ group | 3 | 44.82±2.131) | 75.35±1.361) |
| High-dose icariin group | 3 | 63.83±1.062) | 73.57±0.82 |
| 1) P < 0.01 vs. Control group；2) P < 0.01 vs. STZ group. | |||
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| 图 4 淫羊藿苷与ER1的分子对接 Fig.4 Molecular docking between icariin and ER1 |
2.5 各组大鼠ER1表达比较
免疫组织化学结果显示，与Control组，STZ组股骨组织中ER1表达减少；与STZ组比较，高剂量淫羊藿苷组ER1表达明显增多；与高剂量淫羊藿苷组比较，高剂量淫羊藿苷+ER1-siRNA组ER1表达减少，见图 5。
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| A，Control group；B，STZ group；C，high-dose icariin group；D，high-dose icariin+ER1-siRNA group. 图 5 免疫组织化学检测各组大鼠股骨组织ER1表达 ×200 Fig.5 ER1 expression in bone tissue of rats in each group by immunohistochemistry ×200 |
2.6 Western blotting检测各组大鼠ER1、Wnt和β-cantenin蛋白表达
结果显示，与Control组比较，STZ组大鼠ER1、Wnt和β-cantenin表达降低(均P < 0.01)。与STZ组比较，高剂量淫羊藿苷组大鼠ER1、Wnt和β-cantenin表达升高(均P < 0.01)。与高剂量淫羊藿苷组比较，高剂量淫羊藿苷+ER1-siRNA组大鼠ER1、Wnt和β-cantenin表达降低，说明淫羊藿苷的保护作用被逆转，见图 6、表 5。
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| 1，Control group；2，STZ group；3，high-dose icariin group；4，high-dose icariin+ER1-siRNA group. 图 6 各组大鼠ER1、Wnt和β-cantenin蛋白表达 Fig.6 Protein expression of ER1, Wnt and β-cantenin in rats in each group |
| Group | n | ER1 protein | Wnt protein | β-cantenin protein |
| Control group | 3 | 83.62±1.34 | 72.59±1.08 | 83.12±2.06 |
| STZ group | 3 | 45.28±1.091) | 28.74±0.861) | 51.82±1.781) |
| High-dose icarrin group | 3 | 65.01±0.822) | 65.68±0.742) | 74.11±1.372) |
| High-dose icarrin+ER1-siRNA group | 3 | 42.08±0.943) | 39.72±0.713) | 45.03±1.243) |
| 1) P < 0.01 vs. control group；2) P < 0.01 vs. STZ group；3) P < 0.01 vs. high-dose icarrin group. | ||||
3 讨论
DOP导致骨脆性和骨折风险增加[11-12]。DM患者的高血糖状态可以影响人体正常的骨转换和骨完整性，DM患者的骨质流失及骨转换速度都较正常人增加[13-14]。研究[15]显示，淫羊藿苷对去卵巢大鼠有骨保护作用。本研究结果显示，与Control组比较，STZ组大鼠血糖升高，体重减轻，股骨表面成骨细胞软骨下区骨细胞核固缩，ALP和血钙浓度降低，TRAP升高，表明DOP大鼠模型构建成功。淫羊藿苷治疗后，上述指标均显著改善，说明淫羊藿苷对DOP大鼠具有保护作用。持续高血糖可抑制成骨细胞增殖，促进破骨细胞分化，目前，已有研究[16]认为骨髓中葡萄糖可引起破骨细胞分化增加，这可能是DOP的发病机制之一。本研究结果显示，给药8周后与STZ组比较，高剂量淫羊藿苷组血糖显著降低，表明淫羊藿苷的降糖作用可能是减轻DM所致骨质损伤的重要机制之一。
淫羊藿苷是一种传统中药，可用于减轻炎症和恢复成骨的形成[17]。既往研究[18]表明淫羊藿苷是治疗骨代谢相关疾病的有效药物。淫羊藿苷还能刺激骨髓间充质干细胞或长骨源性细胞的成骨分化，促进骨愈合，预防骨质疏松症，改善股骨头坏死。淫羊藿苷通过抑制骨吸收、提高峰值骨密度和骨质量促进骨形成，对预防不同原因引起的骨质疏松及骨折具有重要意义[9]。
本研究结果显示，与Control组比较，STZ组大鼠股骨表面成骨细胞减少，空骨陷窝明显增多，ALP和血钙浓度水平下降，TRAP水平升高(均P < 0.01)。与STZ组比较，低、高剂量淫羊藿苷组空骨陷窝减少，ALP和血钙浓度水平升高，TRAP水平降低(均P < 0.01)，表明淫羊藿苷能有效改善DOP的病理改变。
已有研究[19]显示ER1基因多态性与骨质疏松症风险相关。本研究核心靶点筛选和分子对接结果发现，淫羊藿苷可以通过GLU-523、ASN-519、GLU-385、SER-456、HIS-516、TYR-459、SER-512、ASN-455和LEU-511氨基酸残基稳定地结合到ER1蛋白结构上。Western blotting检测结果显示，STZ组ER1、Wnt和β-cantenin表达水平较Control组降低，淫羊藿苷治疗后ER1、Wnt和β-cantenin表达上调。而在淫羊藿苷治疗基础上给予ER1-siRNA干扰后，ER1、Wnt和β-cantenin表达减少，淫羊藿苷的保护作用被逆转，表明淫羊藿苷可能通过ER1调节Wnt/β-cantenin信号通路减轻DOP。
综上所述，淫羊藿苷可以降低DM大鼠血糖、提高血清ALP水平和血钙浓度、降低TRAP水平，对DM大鼠骨质疏松症具有保护作用；其机制可能与激活ER1介导的Wnt/β-cantenin信号通路有关。淫羊藿苷可能是治疗DOP的潜在药物。本研究不足之处在于缺少体外实验，今后将进一步探究淫羊藿苷对DOP大鼠的保护机制。
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