钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (Ca²⁺/calmodulin-dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ) 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够将底物磷酸化，并修饰苏氨酸/丝氨酸等重要氨基酸，从而调节心脏的各种生理和病理过程^[1]。CaMKⅡ的靶蛋白种类多样，因而具有广泛的调控作用。CaMKⅡ作用的多样性与其组织分布和亚细胞定位有关。在哺乳动物中，CaMKⅡ由4种不同的亚型(α、β、γ、δ) 组成，具有多种剪接体，虽然高度同源，但因组织分布不同，具有不同的生理功能。CaMKⅡδ主要表达在心肌^[2]，CaMKⅡα和CaMKⅡβ主要表达在中枢神经系统，CaMKⅡγ在多种组织和细胞中均有表达^[3-4]。CaMKⅡ的活性可被直接或间接调节，多样化的CaMKⅡ信号通路有助于广泛调节多种生物活动。CaMKⅡ最初因其在学习记忆中的作用被广泛关注^[4]，后来研究发现其过度激活在心脏疾病的发生中具有核心作用。因此，CaMKⅡ有望成为治疗心血管疾病的关键靶点。

本课题组前期采用膜片钳单通道inside-out技术，发现CaMKⅡ可以消除CaM对L型钙通道run-down现象调节的时间依赖性，用CaMKⅡ处理Ca_V1.2通道的C末端片段(CT1) 后，CaM与CT1的结合能力增加，说明CaMKⅡ磷酸化可提高CaM与Ca_V1.2通道的结合能力，进而调节L型钙通道功能。目前研究表明，CaMKⅡ在心肌肥厚^[5]、心律失常^[6]、心力衰竭^[7]、缺血性心脏病和扩张性心肌病等的发生和发展中都具有重要作用。提取高纯度的CaMKⅡ在相关心血管疾病研究中具有重要意义，但应用常规技术手段提取CaMKⅡ蛋白的效果一直不佳。

本研究通过改进酶切温度和时间，成功构建长片段CaMKⅡ重组质粒并制备纯化长片段CaMKⅡ蛋白，采用SDS-PAGE鉴定纯化后GST-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白分子量和相对纯度；采用pull-down结合Western blotting检测长片段CaMKⅡ与Ca_V1.2通道的结合能力，为研究CaMKⅡ与钙通道Ca_V1.2的相互作用及其分子机制奠定了重要的生物学基础，为进一步研究CaMKⅡ在心血管疾病中的作用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

原核表达载体pGEX-6P-1、BL-21感受态细胞，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成和提供；DL-二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)、氨苄西林(ampicillin，Amp)、溶菌酶(lysozyme，LYS)、膜再生液，购自北京索莱宝科技有限公司；三色预染蛋白marker，购自上海雅酶生物医药科技有限公司。CaMKⅡ抗体，购自英国abcam公司；Ca_V1.2抗体，购自美国Omnimabs公司；山羊抗兔IgG (H+L) 二抗，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 长片段CaMKⅡ重组质粒的提取和鉴定

将pGEX-6p-1/CaMKⅡ重组质粒TOP10 (60 μL) 细菌接种在含50 μg/mL Amp的1×LB液体培养基中，摇床培养箱中培养12 h。10 000 g离心1 min，收集菌液。参照SanPrep柱式质粒试剂盒说明书提取质粒，测定质粒DNA浓度，将质粒DNA送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序，应用PubMed网站的BLAST软件比对重组质粒同源性。

1.3 BL21感受态细胞的转化

将pGEX-6P-1/CaMKⅡ质粒转入100 μL大肠杆菌BL21中，冰上静置30 min。42 ℃水浴45 s，快速放回冰上，静置2 min。搅拌混匀，在37 ℃、摇床转速为200 r/min下复苏60 min。5 000 r/min离心1 min，取菌液50 μL均匀涂于含50 μg/mL Amp的1×LB固体培养基上。在37 ℃细菌培养箱中培养12~16 h^[8]。

1.4 重组质粒pGEX-6P-1/CaMKⅡ的诱导和表达

将重组质粒pGEX-6P-1/CaMKⅡ成功转入大肠杆菌BL21后，加入200 mL无菌1×LB培养液，同时加入200 μL Amp (50 mg/mL)，在37 ℃、摇床转速为110 r/min下振荡过夜。测定菌液光密度，待600 nm波长处光密度值为0.6~1.0时，加入IPTG进行诱导，在37 ℃、摇床转速为130 r/min下振荡4 h。

1.5 CaMKⅡ蛋白的提取

重组蛋白诱导表达4 h后，将200 mL菌液分装到50 mL无菌离心管中，配平，4 000 r/min离心10 min后弃掉上清，留取沉淀。将沉淀用PBS重悬，加入100 μL LYS (0.1 mg/mL) 和100 μL DTT (1 mol/L)，充分混匀后冰上静置30 min，7 ℃~8 ℃超声处理20 min。16 000 g离心10 min，将上清与PBS洗过2遍的300 μL GS-4B在4 ℃孵育，摇晃过夜^[9]。次日早晨，1 000 r/min离心，弃上清，GS-4B用5 mL Tris缓冲液1 000 r/min离心4次，转移至2 mL EP管中，加入295 μL Tris缓冲液和4 μL PreScission蛋白酶，室温旋转8 h，800 r/min离心3 min后取上清，得到长片段CaMKⅡ蛋白。

采用相同技术，从膜蛋白Ca_V1.2中提取出GST-CT1融合蛋白。在重悬液中加入LYS和DTT，冰上静置30 min，超声处理后，加入15% N-月桂酰肌氨酸，再次冰上静置30 min，但不进行PreScission蛋白酶酶切步骤，用于后续鉴定与CaMKⅡ的结合。

1.6 纯化后蛋白纯度和浓度的测定

1.6.1 CaMKⅡ纯度的测定

取制备的GST-CaMKⅡ与酶切后CaMKⅡ蛋白各10 μL，加入5 μL 1×上样缓冲液，100 ℃金属浴5 min后，15% SDS-PAGE电泳80 V 30 min、110 V 90 min后，考马斯亮蓝染色1 h，根据蛋白条带位置，比对蛋白marker条带位置，评估目的蛋白纯度。

1.6.2 CaMKⅡ蛋白浓度的测定

以牛血清白蛋白作为标准蛋白，绘制标准曲线，计算CaMKⅡ蛋白浓度。

1.7 CaMKⅡ蛋白活性的鉴定

采用pull-down结合Western blotting检测CaMKⅡ生物学活性。GS-4B连接的GST-CT1 (40 μL) 加入0.7 μmol/L CaMKⅡ，加入CaCl₂至终浓度为2 mmol/L，同时加入Tris缓冲液补齐至300 μL体系中，于旋转培养器4 ℃结合4 h；反应后用含2 mmol/L Ca²⁺的Tris缓冲液1 000 r/ min离心GS-4B 3遍。再向其中加入10 μL1×上样缓冲液，金属浴100 ℃、5 min后，经SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜5 min×3次后，Ca_V1.2抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜7 min×3次后，二抗(1∶50 000) 室温孵育1 h，TBST洗膜7 min×3次，ECL显影。用膜再生液孵育20 min后，用新鲜配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜5 min×3次后，CaMKⅡ抗体(1∶2 000) 4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜5 min×3次后，二抗(1∶50 000) 室温孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL显影。

2 结果 2.1 重组质粒DNA测序结果

DNA测序结果显示，CaMKⅡ重组质粒含有1 614 bp DNA片段。通过BLAST软件比对，同源性为100%，读码框架一致，且插入方向一致，表明重组质粒构建成功。见图 1。

2.2 纯化后CaMKⅡ蛋白分子量和纯度

CaMKⅡ蛋白表观分子量约为54×10³。在表观分子量约为80×10³ (GST-CaMKⅡ) 和54×10³ (CaMKⅡ) 处出现明显条带，与预期结果相符，表明已经成功获得纯度较高的CaMKⅡ蛋白。见图 2。

2.3 纯化后蛋白浓度测定

采用牛血清白蛋白作为标准蛋白，绘制标准曲线，计算CaMKⅡ蛋白浓度为0.59 mg/mL。

2.4 CaMKⅡ蛋白活性

将纯化后的CaMKⅡ蛋白与Ca_V1.2通道蛋白上GST-CT1蛋白片段相互作用，电化学发光在表观分子量约54×10³处出现明显条带，见图 3。说明纯化后的CaMKⅡ蛋白与钙通道蛋白CT1结合能力强，提示具有生物学活性。

3 讨论

CaMKⅡ是一类由Ca²⁺调控的蛋白激酶，当细胞内Ca²⁺增加时，Ca²⁺结合型钙调蛋白(Ca²⁺/CaM) 与CaMKⅡ结合，将假底物从催化结构域中移出，使CaMKⅡ能够接触底物和ATP，进而发挥其活性。CaMKⅡ的瞬时激活是可逆的：当细胞内Ca²⁺浓度降低时，CaM脱钙并与CaMKⅡ解离；当细胞内Ca²⁺浓度持续升高时，CaMKⅡ持续激活，这一过程常发生在心动过速或心肌动作电位延长期间。此时CaMKⅡ第287位的苏氨酸(T287，CaMKⅡα中为T286) 发生自身磷酸化，T287自身磷酸化通过2种机制使CaMKⅡ可以不受Ca²⁺浓度的调节：(1) 由于CaMKⅡ与CaM的亲和力增加了数千倍，从而增加了与CaM的持续结合；(2) CaMKⅡ也通过降低假底物与催化结构域的亲和力，促进自身磷酸化。此外，CaMKⅡ也可由氧化应激、亚硝化应激以及高血糖等刺激而激活^[10]。CaMKⅡ通过磷酸化下游多种靶点^[11] (如兰尼定受体、肌浆网钙ATP酶、受磷蛋白等) 参与心肌细胞兴奋收缩偶联。因此，CaMKⅡ被认为是心律失常、心肌肥厚和心力衰竭的核心靶蛋白。

心脏中CaMKⅡ的亚型主要为CaMKⅡδ^[12]。目前已经确定，CaMKⅡδ经过选择性剪接后有11个剪接变体(CaMKⅡδ1~ CaMKⅡδ11)，其中CaMKⅡδ2/C、CaMKⅡδ3/B和CaMKⅡδ9的研究最多。本研究提取的CaMKⅡ蛋白不仅在54×10³处有明显条带，在40×10³和15×10³处也有明显条带，推测这与CaMKⅡ的剪接体存在形式有关。

CaMKⅡ是细胞内的重要调节因子，与多种心血管疾病及其他系统疾病密切相关。本研究成功构建了CaMKⅡ质粒，该质粒能够很好地在大肠杆菌中表达，经过GS-4B beads纯化后，具有较高的纯度、浓度以及生物活性。纯化后的CaMKⅡ可用于后续Ca²⁺/CaM/CaMKⅡ调节机制的研究，为进一步阐明CaMKⅡ相关疾病的发病机制和提供精准的治疗策略奠定了生物学基础。