特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种较为常见的慢性炎症性皮肤病，以皮肤瘙痒、反复发作的湿疹样皮损为主要临床特征^[1]。其发病与遗传、环境、自身免疫等因素密切相关，其中外源性AD的加重与屏障功能障碍和外来过敏原渗透侵入有关，皮肤屏障破坏使患者的皮肤对环境过敏原（尘螨、动物皮屑、草花粉等）高度易感^[2]。

白细胞介素（interlukin，IL）-18是IL-1家族细胞因子^[3]，在许多过敏性疾病表达增加，能引起严重的过敏性炎症反应^[4]。IL-18与IL-18受体（interleukin-18 receptor，IL-18R）结合能促进Th1细胞相关因子的释放，导致Th1/Th2失衡。IL-18结合蛋白（interleukin-18 binding protein，IL-18BP）是一种糖蛋白，能抑制IL-18诱导Th1细胞产生γ干扰素（interferon-γ，INF-γ），是IL-18的天然拮抗剂，与IL-18协调作用参与细胞免疫反应^[5]，二者在多种炎症性皮肤病和自身免疫性疾病中表达增加^{[4, 6]}。体内多种免疫细胞（如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和中性粒细胞）及肥大细胞和嗜碱性粒细胞可表达IL-18^[7]。但是，关于过敏原对AD患者血液单核细胞和B淋巴细胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达情况却知之甚少。因此，本研究拟探讨AD患者外周血B淋巴细胞和单核细胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达情况，以及过敏原对其表达的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

主要试剂：Zombie Green^TM Fixable Viability Kit、Human TruStain FcX^TM、PE/Cy7-CD14、APC/Cy7-CD19、BV510驴抗兔IgG抗体、红细胞裂解液、布雷非德菌素A（Brefeldin A，BFA），购自美国Biolegend公司；APC-IL-18Rα、APC-IL-18Rα同型、PE-IL-18、PE-IL-18同型，购自美国R & D Systems公司；兔抗人IL-18BP抗体、兔IgG同型对照抗体，购自美国NOVUS公司；大籽蒿过敏原提取物（Artemisia sieversiana wild allergen extract，ASWE）、尘螨过敏原提取物（house dust mite allergen extract，HDME）、梧桐花粉过敏原提取物（Platanus pollen allergen extract，PPE），购自北京新华联协和药业有限责任公司（中国）；Cytofix /CytopermTM固定/透膜试剂盒购自美国BD Biosciences Pharmigen公司。主要仪器：低温高速离心机购自美国Thermo Scientific公司，FACSVerse流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 研究对象和样本采集

选取2021年11月至2022年12月就诊于锦州医科大学附属第一医院皮肤科的AD患者28例（AD组），其中，女17例，男11例，年龄17（1~64）岁；ASWE阳性25例，HDME阳性25例，PPE阳性25例。选取同期我院健康体检志愿者21例作为健康对照组，其中，女11例，男10例，年龄33（29~41）岁。AD诊断符合AD Williams诊断标准，入组患者要求停止服用抗过敏药物≥2周。本研究获得锦州医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准（审批号202397），所有研究对象知情同意。采集所有研究对象的外周静脉血于含有EDTA抗凝剂的采血管中，用于流式细胞检测。

1.2.2 流式细胞术检测外周静脉血B淋巴细胞和单核细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达

取100 μL外周静脉血标本，置入2 mL EP管中；分别加入1.0 μg/mL的ASWE、HDME、PPE 3 μL，并加入2 μL BFA，37 ℃孵育1 h；每管加入FITC去死细胞染料和人Fc受体阻断剂，室温避光孵育15 min；依次加入表面抗体PE/Cy7-CD14、APC/Cy7-CD19和APC-IL-18Rα，荧光减一（fluorescence minus one，FMO）对照管加入相应的表面同型抗体，室温避光孵育15 min；裂解红细胞后用固定/透膜液固定细胞，加入PE-IL-18和抗人IL-18BP一抗，FMO对照管加入相应的胞内同型抗体，4 ℃避光孵育30 min；透膜洗液清洗，加入BV510 Secondary Ab驴抗兔抗体，4 ℃避光孵育30 min；透膜洗液清洗，PBS重悬细胞，流式上机检测。使用FlowJo_v10.6.2软件进行数据分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件和SPSS 17.0软件进行统计分析。用非参数Mann-Whitney检验评估静息状态和不同过敏原刺激后健康对照组和AD组指标的差异，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

流式细胞术分别检测B淋巴细胞和单核细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达，设门方法见图 1。

2.1 B淋巴细胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达

与健康对照组比较，AD组静息状态下血液中CD19⁺B淋巴细胞比例增加，差异有统计学意义（P = 0.003），3种过敏原对B淋巴细胞比例的影响不显著（图 2）。

与健康对照组比较，AD患者静息状态下B淋巴细胞群中IL-18⁺细胞比例升高2.01倍（图 3A），IL-18BP⁺细胞比例升高10.35倍（图 3B），IL-18R⁺细胞比例升高20.85倍（图 3C），过敏原ASWE、HDME和PPE对B淋巴细胞上的IL-18、IL-18BP和IL-18R表达影响不显著。

2.2 单核细胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达

静息状态下健康对照组和AD组CD14⁺单核细胞比例无统计学差异（P > 0.05），3种过敏原对单核细胞比例的影响不显著（图 4）。与健康对照组比较，AD组静息状态下单核细胞群中IL-18⁺细胞比例升高5.51倍（图 5A），IL-18BP⁺细胞比例升高41.88倍（图 5B），而IL-18R⁺细胞比例无明显变化（图 5C），过敏原ASWE、HDME和PPE对单核细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R表达影响不显著。

3 讨论

AD也称为特应性湿疹、遗传过敏性湿疹等，曾称为异位性皮炎。其特征为本人或其家族中具有明显的“特应性”特点，是最常见的皮肤科疾病之一^[8]。AD患者血清中IL-18水平升高，本研究结果显示，AD患者血液中B淋巴细胞和单核细胞IL-18⁺细胞的比例明显升高，提示炎症性皮肤疾病患者血液IL-18水平的升高可能与B淋巴细胞和单核细胞有关^[6]。IL-18是一种多效促炎性细胞因子，在炎症过程中起双相调节作用，可以调控Th1和Th2型免疫应答，调节IgE的合成，主要由活化的单核巨噬细胞产生^[9]。

AD患者外周血中单核细胞可产生大量前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），后者又可直接刺激B淋巴细胞产生IgE ^[10]。研究^[11]发现，AD的发病机制部分由Th2介导，Th2促进IL-4和IL-13的产生并诱导IgE，而IL-18能够增强Th2应答。IgE和肥大细胞可以促进多种炎症介质的产生，故IL-18有助于评估AD发生发展，抑制IL-18可能是AD潜在的治疗靶点。

IL-18成熟活化后，通过IL-18R参与多种生物学功能。IL-18R由异源二聚体组成，即α链（IL-18Rα）和β链（IL-18Rβ）^[12]。IL-18Rα在大多数细胞中表达，而IL-18Rβ链只有少数细胞如T细胞、树突状细胞和肥大细胞表达^[13]。IL-18通过与细胞表面的IL-18Rα相互作用，在机体防御及致病过程中发挥其生物学功能。有研究^[14]发现，儿童过敏性哮喘患者肺组织中嗜酸性粒细胞增多，并伴有IL-18R⁺表达增加。也有研究^[15]显示，过敏性鼻炎合并哮喘患者血液中嗜酸性粒细胞IL-18R⁺细胞的比例与正常对照组比较无统计学差异。本研究结果显示，AD患者血液单核细胞中IL-18R⁺细胞的比例与健康对照组相比无统计学差异，而B细胞中IL-18R⁺细胞的比例明显升高。提示B细胞表面的IL-18R可能在AD中起重要作用，但其机制需进一步研究。

IL-18BP是一种受体样可溶性蛋白，是IL-18的内源性拮抗剂，通过抑制IL-18与IL-18R的结合，减少IFN-γ的产生，从而抑制Th1免疫应答^[16]。而IL-18/IL-18BP平衡的失调可能有助于Th1慢性炎症的发生^[6]。研究^[17]发现，IL-18BP在炎症和自身免疫性疾病患者中表达增加，通常与IL-18水平升高同时发生。本研究结果表明，AD患者血液中B淋巴细胞和单核细胞中IL-18⁺细胞和IL-18BP⁺细胞的比例均明显升高，提示IL-18与IL-18BP的失衡可能诱导AD的发生，为AD的治疗提供了新思路。

综上所述，本研究发现，B淋巴细胞及单核细胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R可能在AD中起重要作用，这3种IL可能是治疗AD的潜在靶点。