阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种多原因导致的神经退行性疾病，临床表现为认知功能下降、行为障碍、记忆力受损等^[1]。目前AD的发病机制尚不清楚，多数研究认为淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）代谢紊乱和β淀粉样蛋白（amyloid-β protein，Aβ）沉积是AD最早的分子驱动因素。APP水解主要基于α途径，少量APP被β分泌酶水解，产生不溶性Aβ₄₀和Aβ₄₂。与Aβ₄₀相比，Aβ₄₂更先沉积于海马体、大脑皮质等神经元和毛细血管中，产生病理级联反应，导致斑块形成、神经纤维缠结（neuro fibrillary tangle，NFT）形成、tau蛋白异常磷酸化、突触丢失等，最终导致神经元死亡，故Aβ₄₂被认为与AD的关系更紧密^[2-4]。因此，本研究选择Aβ₄₂作为研究对象，探讨其与钙调蛋白（calmodulin，CaM）的结合作用。

CaM是一种具有钙离子结合功能的蛋白，在长时程增强作用（long-term potentiation，LTP）、抑郁、记忆障碍和神经退行性疾病过程中发挥重要作用^[5]。研究^[6]发现，Aβ_1-42与Ca²⁺/CaM存在直接相互作用，CaM与Aβ_1-42结合能减缓Aβ原纤维的形成。当AD发生时，神经元细胞内Ca²⁺浓度显著增高^[7]。钙超载状态下CaM与Aβ_1-42之间的结合情况尚未见研究。因此，本研究利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库筛选高通量测序数据集，进行功能富集分析并获取核心基因，构建GST-Aβ_1-42重组质粒，表达、提取、纯化GST-Aβ_1-42融合蛋白，进而探讨GST-Aβ_1-42蛋白与CaM的相互作用，以期为AD治疗提供新靶点、新思路。

1 材料与方法 1.1 材料

大肠杆菌BL21（DE3）（北京全式金生物公司）；pGEX-6p-1/ Aβ_1-42（中国Sangon Biotech公司）；异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopy-ranoside，IPTG）、氨苄西林、溶菌酶（美国Sigma公司）；Protein Molecular Weight Marker（日本TaKaRa公司）；限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ（美国Thermo Scientific公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（中国Biosharp公司）。Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；SanPrep柱式抽提试剂盒（中国Sangon Biotech公司）。凝胶自动成像仪（DNR Bio-Imaging systems，上海中晶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学方法筛选核心基因、确定靶蛋白

GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查询AD数据集，下载GSE173955高通量测序数据集，该数据集包括8例AD患者及10例健康人的样本。用GEO数据库GEO2R工具进行在线分析，筛选出差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）。以P < 0.05和∣logFC∣ > 1作为条件进行筛选，对生成的数据进行统计学分析，得到的基因为最终的DEG。使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）对P值由小到大排名的前6 000个DEG进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。将P值由小到大排名前200的DEG导入STRING数据库（https://www.string-db.org/）生成蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，并使用cytoscape得到各个基因的连接度，将连接度排名前20的基因定义为核心基因。

1.2.2 构建GST-Aβ_1-42重组质粒

应用42 ℃精确热激法将Aβ_1-42质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。在含氨苄西林的LB固体琼脂培养板上均匀涂抹菌液，将培养板置于37 ℃培养箱内倒置培养12~16 h。取单克隆菌种接种于含氨苄西林的LB培养液中，震荡培养12~16 h。保留菌种，置于高压灭菌含50 %甘油的EP管中，混匀并保存于-80 ℃冰箱备用。取100 μL菌种加入至含50 μg/mL氨苄西林LB培养液的培养基中，振摇12~16 h。当达到对数生长期，即OD_{600 nm}在0.6~1.0范围内时，加入400 μL IPTG（终浓度为1 mmol/L），振摇4 h，诱导融合蛋白表达。

1.2.3 提取和纯化GST-Aβ_1-42融合蛋白

离心收集细菌，向菌液中分别加入20 mg/mL溶菌酶和1 mol/L DTT 200 μL，冰上处理30 min。超声破碎细菌，12 000 r/min离心取上清，加入预先用PBS洗好的beads中，过夜孵育。

1.2.4 pull-down实验检测CaM与GST-Aβ_1-42蛋白间的相互作用

向40 μL连接于GS-4B beads的GST-Aβ_1-42融合蛋白中加入3 μL 0.001 mol/L CaCl₂（[Ca²⁺]10 μmol/L）和不同浓度的CaM（终浓度分别为0.1、0.3、1.0、3.0、5.0、10.0 μmol/L），在300 μL体系的Tris缓冲液（pH8.0）中，4 ℃孵育4 h，用相应浓度的Ca²⁺缓冲液清洗2次。用考马斯亮蓝对经15% SDS-PAGE电泳的蛋白凝胶染色，脱色2 h，扫描胶图检测CaM与GST-Aβ_1-42蛋白间有无相互作用。

1.3 统计学分析

使用ImageJ软件统计SDS-PAGE电泳条带的灰度值，应用GraphPad Prism 8软件绘制柱形图。数据以x±s表示，采用t检验比较组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 筛选核心基因并确定靶蛋白（图 1）

通过GEO2R获得20 731个DEG，进一步筛选后按P值由小到大排序选前6 000个基因进行GO和KEGG分析。如图 1A所示，GO分析DEG分子功能主要富集在蛋白结合、ATP结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、金属离子结合、钙调蛋白结合、钙离子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、肌动蛋白结合、电压门控钾通道活性等；如图 1B所示，KEGG分析DEG主要富集在亨廷顿病、多种神经退行性疾病通路、轴突导向、突触囊泡循环、细胞内吞作用、朊病毒病、糖尿病性心肌病、AD、肌萎缩侧索硬化症等。将前200个DEG导入STRING数据库生成PPI网络图，用cytoscape将数据可视化，获取连接度排名前20的核心基因，如图 1C所示，包括HSPA8（连接度=16）、ATP5F1（连接度=13）、VDAC1（连接度=12）、TPI1（连接度=12）、YWHAB（连接度=11）、PGK1（连接度=11）、COX5A（连接度=11）、CCT2（连接度=10）、YWHAG（连接度=10）、NDUFC2（连接度=10）、NDUFA5（连接度=9）、CLTC（连接度=9）、RAN（连接度=9）、NDUFB5（连接度=9）、UQCRH（连接度=8）、CALM3（连接度=7）、RCN2（连接度=7）、CAMK2D（连接度=7）、PPP3CB（连接度=7）、CALM1（连接度=6）。通过分析发现CALM3、CAMK2D、CALM1都参与编码CaM，故将CaM作为靶蛋白进行后续实验验证。

2.2 Aβ_1-42重组质粒的酶切鉴定

Aβ_1-42重组质粒的DNA测序结果如图 2所示，经Pubmed核酸比对软件进行比对分析，重组质粒的碱基与基因库碱基比对，两者同一性为100%，且插入方向正确，读码方向正确，密码子无突变、缺失，测序结果证明本研究重组质粒构建成功。重组质粒经BamHⅠ/NotⅠ双酶切后，如图 3所示，Aβ_1-42基因片段分子量大小与理论值符合，进一步说明重组质粒构建成功。

2.3 GST-Aβ与CaM的结合作用

在2 mmol/L Ca²⁺条件下，共同孵育不同浓度CaM蛋白（0.1，0.3，1.0，3.0，5.0，10.0 µmol/L）和纯化后的GST-Aβ_1-42融合蛋白，pull-down实验结果如图 4所示，CaM蛋白能与GST- Aβ_1-42蛋白结合，且具有浓度依赖性。

3 讨论

随着全球人口老龄化，AD给社会和家庭带来的问题愈加严重。目前，仍然缺乏治疗AD的特效药物。钙调蛋白假说作为钙假说的延伸，表明了钙调蛋白参与Aβ蛋白形成与发展的过程。与产生Aβ的相关蛋白均具有特定的钙调蛋白结合域，且能够与CaM结合并受其调节。尽管AD发病机制尚未明确，但一直以来Aβ假说都是解释AD发病机制的一个重要理论基础和研究依据^[8]。Aβ斑块和NFT被广泛认为是AD的2个核心特征。有大量证据表明，CaM在Aβ斑块形成的早期发挥重要作用^[9-10]。研究发现，CaM的干扰可能能减少Aβ斑块的产生。BACE1不仅与CaM结合，且其活性通过CaM以剂量依赖性方式显著增加。CaM除能与产生Aβ的酶结合外，还能直接与Aβ_1-42本身结合^[11]。当Aβ_1-42与CaM结合时，Aβ不能抑制脑质膜Ca²⁺-ATPase并阻止Ca²⁺进入细胞。以上研究结果表明，在淀粉样蛋白斑块形成途径中，Aβ_1-42和CaM之间存在明显的联系，Ca²⁺水平的失衡与Aβ产生相互促进，CaM在这种相互作用中起着非常重要的作用^[13]。研究^[12-13]证实，CaM/Ca²⁺与CaMKⅡ结合使其磷酸化才能发挥CaMKⅡ的记忆功能，而AD患者脑内CaM含量明显减少，导致AD患者记忆能力下降。前期研究已证实CaM能够与Aβ相互作用，减缓Aβ纤维原的形成，在此基础上，本研究创新性地证实了在钙超载的条件下CaM与Aβ_1-42的结合作用，更进一步地证明了两者的结合呈浓度依赖性，其结合量随着CaM浓度的增加而增加。

虽然近年来AD患者数量不断增加，但其治疗方法并没有显著进展。Aduhelm（阿杜那单抗）是自2003年以来首个获批用于AD的新型疗法，而在此之前仅有几款药物用于缓解AD，包括多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀、美金刚，以及多奈哌齐和美金刚的复方制剂^[14]。2019年由我国自主研发的创新药甘露特钠胶囊获批上市，用于治疗轻度或中度AD。然而，这些药物都是用于改善或预防AD的发生和发展，并不能精准有效地遏制AD的发展。2023年1月美国食品药品管理局批准仑卡奈单抗（lecanemab）用于治疗AD，它从根本上解决了AD病因——清除淀粉样斑块，进而改善患者早期的认知障碍^[15-16]。已有文献^[5]报道，CaM与Aβ_1-42结合可影响LTP，导致学习和记忆障碍，但目前尚未见以CaM为靶点的AD治疗药物。迄今为止，几乎所有的临床试验都是单一治疗试验，鉴于AD的复杂性，未来联合用药可能成为治疗AD的趋势^[14]。

综上所述，本研究发现，GST-Aβ_1-42蛋白能够与CaM结合，且具有浓度依赖性，为AD治疗药物潜在作用靶点的研究提供了新思路。