血管内膜增生是造成许多血管增生性疾病的主要原因之一，而血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖与迁移已被证实在血管内膜增生中扮演重要角色^[1]。VSMC的增殖与迁移与细胞因子及血管活性物质的刺激、VSMC的表型转化以及细胞内自噬水平等息息相关。VSMC由收缩表型向合成表型转化是VSMC发生增殖与迁移的重要环节，血管活性物质血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）能促进VSMC的表型转化以及自噬，而自噬水平的改变被认为可能是VSMC发生表型转化的重要机制。因此，通过调控自噬水平阻断AngⅡ诱导的VSMC表型转化可能成为预防血管内膜增生的治疗靶点，但目前针对血管内膜增生的临床药理学干预效果仍不理想。丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TanⅡA）是丹参的主要有效成分，具有抑制血管过度增殖及诱导细胞凋亡、抗血小板凝集、保护血管内皮细胞、抗氧化等作用^[2-4]，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。本研究采用AngⅡ诱导VSMC增殖及迁移，建立细胞模型，采用CCK-8法、细胞划痕试验和Western blotting法观察TanⅡA在AngⅡ诱导VSMC增殖及迁移中的作用，并观察加入自噬抑制剂3-MA后，AngⅡ诱导的VSMC增殖及迁移是否发生变化，从而探讨TanⅡA抗血管内膜增生的可能机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠主动脉平滑肌细胞购自American Type Culture Colection细胞库。

1.1.2 药品与试剂

丹参酮ⅡA和二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）购自美国Sigma公司；血管紧张素Ⅱ购自北京索莱宝公司；3-甲基腺嘌呤购自中国TOCRIS公司；胎牛血清、胰酶、DMEM高糖培养液和青-链霉素购自美国Gibco公司；Cell counting kit 8试剂盒购自日本同仁化学研究所；α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体购自美国NOVUS公司；骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体购自美国R & D Systems公司；β-actin抗体、p62抗体和LC3A/B抗体购自美国Affinity公司；Beclin-1抗体购自中国Abmart公司；山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG购自美国EARTHOX抗体公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠主动脉VSMC呈梭形，贴壁生长，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养于5%CO₂、37 ℃的细胞培养箱中，每3 d换液1次。

1.2.2 细胞分组

为探索AngⅡ建立细胞增殖模型的最适浓度和时间，先分为正常对照（NC）组，10^-7 mol/L AngⅡ组，10^-6 mol/L AngⅡ组和10^-5 mol/L AngⅡ组。AngⅡ建立细胞增殖模型后分为TanⅡA干预组和3-MA处理+TanⅡA干预组。其中TanⅡA干预组分为正常对照（NC）组、AngⅡ（10^-6 mol/L）组、TanⅡA（4 μg/mL）组、TanⅡA（8 μg/mL）组、TanⅡA（12 μg/mL）组、TanⅡA（16 μg/mL）组，3-MA处理+TanⅡA干预组分为正常对照（NC）组、AngⅡ组（10^-6 mol/L）、TanⅡA（8 μg/mL）组、3-MA（5 mmol/L）组。

1.2.3 CCK-8检测

1.2.3.1 AngⅡ建立细胞增殖模型的最适浓度和时间

将对数生长期的VSMC种入96孔板中，于培养箱中过夜培养，在细胞贴壁后取出培养基，根据AngⅡ分组，除NC组外，其余实验组依次加入不同浓度（10^-7 mol/L、10^-6 mol/L、10^-5 mol/L）AngⅡ，每组设5个复孔，置于细胞培养箱培养24和48 h后，弃培养液，于避光条件下向每个复孔加入100 μL DMEM培养基和CCK-8液的混合液（配置比10∶1），培养1 h后终止，在酶标仪450 nm波长下读取各孔的吸光度数值。

1.2.3.2 TanⅡA对VSMC增殖的抑制作用

将对数生长期的VSMC接种至96孔板，于培养箱中培养过夜，在细胞贴壁后取出培养基，用AngⅡ（10^-6 mol/L）处理细胞48 h后，除NC组、AngⅡ组外，其余实验组依次加入4、8、12、16 μg/mL TanⅡA，每组包括5个复孔，置于细胞培养箱培养24和48 h后，弃培养液，于避光条件下向每个复孔加入100 μL DMEM培养基和CCK-8液的混合液（配置比10∶1），培养1 h后终止，在酶标仪450 nm波长下读取各孔的吸光度数值。

1.2.3.3 3-MA对VSMC增殖的抑制作用

将对数生长期的VSMC接种至96孔板中，置于培养箱中过夜，细胞贴壁后吸出培养基，用AngⅡ（10^-6 mol/L）处理细胞48 h后，除对照组、AngⅡ组外，其余实验组依次加入TanⅡA（8 μg/mL）、3-MA（5 mmol/L）。每组包括5个复孔，置细胞培养箱培养24 h，于避光条件下向每个复孔加入100 μL DMEM培养基和CCK-8液的混合液（配制比10∶1），加液环节避免引入气泡，培养1 h后终止，在酶标仪上测定每孔450 nm处吸光度值。

1.2.4 划痕试验

将VSMC接种于6孔板中，培养至80%密度，吸出培养基，AngⅡ（10^-6 mol/L）处理细胞48 h后，用200 μL移液管尖在平板上划出一道笔直划痕，按照实验分组（TanⅡA干预组、3-MA处理+TanⅡA干预组）分别处理细胞24 h。24 h后用倒置显微镜拍摄，采用ImageJ1.53a版图像处理软件并根据恢复面积百分比分析细胞迁移程度。

1.2.5 Western blotting

AngⅡ（10^-6 mol/L）处理细胞48 h并按照实验分组（TanⅡA干预组、3-MA处理+TanⅡA干预组）分别处理细胞24 h后，使用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测配平蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，室温摇床封闭1 h，分别加入鼠抗α-SMA抗体（1∶2 000）、鼠抗OPN抗体（1∶2 000）、鼠抗Beclin-1抗体（1∶1 000）、兔抗p62抗体（1∶1 000）、兔抗LC3A/B抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗涤后再加入相应的二抗（1∶10 000）室温孵育1h，采用全自动化学发光成像分析系统行化学发光法检测，以β-actin蛋白表达为内参，结果以靶蛋白/内参的灰度比值表示。

1.3 统计学分析

采用GraphPadPrism9.0软件进行统计分析，2组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，数据以x±s表示，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 AngⅡ诱导VSMC的增殖

采用CCK-8法比较不同浓度AngⅡ、不同时间VSMC的增殖情况。结果发现AngⅡ处理48 h可明显增加VSMC的增殖率，但10^-5 mol/L AngⅡ作用细胞后的增殖率比中、低浓度低，考虑10^-5 mol/L AngⅡ对VSMC可能有毒性作用，而AngⅡ浓度为10^-6 mol/L时，细胞增殖率达到峰值，因此后续选用10^-6 mol/L AngⅡ作用VSMC 48 h建立细胞增殖模型。见图 1。

2.2 TanⅡA抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖

应用CCK-8法对比各浓度条件下TanⅡA处理AngⅡ刺激的细胞增殖状况，与单独使用AngⅡ干预组比较，细胞经不同浓度的TanⅡA处理24 h、48 h后均能够降低由AngⅡ诱导的细胞增殖，且与TanⅡA的浓度呈负相关。见图 2。在4、8、12 μg/mL浓度时，TanⅡA处理细胞24 h时增殖率下降更明显，因此选用不同浓度的TanⅡA（4、8、12、16 μg/mL）作用细胞24 h进行后续实验。

2.3 TanⅡA抑制AngⅡ诱导的VSMC迁移

划痕实验结果显示，AngⅡ组VSMC的迁移率（78.75%）能力较正常对照组（45.27%）明显升高，给予各浓度TanⅡA干预后，与AngⅡ组相比，随着TanⅡA浓度升高（4、8、12、16 μg/mL），细胞迁移率（48.05%、40.53%、24.46%、5.57%）逐渐下降。见图 3。

2.4 TanⅡA对AngⅡ诱导VSMC表型转化的影响

Western blotting结果（图 4）显示，与对照组比较，AngⅡ组VSMC收缩表型蛋白α-SMA表达明显降低，合成表型蛋白OPN表达显著增加。经TanⅡA处理后，与AngⅡ组相比，α-SMA表达上调，OPN表达下调，且随着TanⅡA浓度升高，α-SMA表达水平逐渐增加，OPN表达水平逐渐下降。

2.5 TanⅡA对AngⅡ诱导VSMC的自噬影响

Western blotting检测自噬标志物p62、Beclin-1、LC3A/B。结果显示，与对照组比较，AngⅡ组p62、Beclin-1、LC3A/B的表达水平显著增加。与AngⅡ组相比，TanⅡA可下调p62、Beclin-1、LC3A/B的表达，并且随着TanⅡA浓度升高，p62、Beclin-1、LC3A/B的表达水平逐渐下降。见图 5。

2.6 自噬抑制剂3-MA抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖、迁移和表型转化

在使用TanⅡA干预细胞前使用3-MA预处理细胞2 h（TanⅡA浓度根据前期CCK-8实验选择中位浓度8 μg/mL）。CCK-8检测结果显示，AngⅡ组、TanⅡA组、3-MA组增殖率分别为1.19±0.02、0.70±0.08、0.94±0.12，与AngⅡ组比较，TanⅡA组、3-MA组均明显抑制VSMC的增殖。细胞划痕实验结果显示，AngⅡ组、TanⅡA组、3-MA组迁移率分别为0.79±0.01、0.37±0.02、0.21±0.08，与AngⅡ组比较，TanⅡA组、3-MA组均明显抑制VSMC的迁移。

Western blotting检测结果显示，与AngⅡ组比较，TanⅡA组和3-MA组α-SMA蛋白的表达升高，OPN的表达降低。再通过Western blotting检测自噬标志物p62、Beclin-1、LC3A/B，与AngⅡ组比较，TanⅡA组、3-MA组和3-MA+TanⅡA组Beclin-1、LC3A/B的表达均明显降低。见图 6。

3 讨论

VSMC的增殖及迁移在血管内膜增生的发生发展中起重要作用^[5]。VSMC具有可塑性，可以在收缩表型和合成表型之间转化。正常生理状态下，VSMC处于静止的收缩表型，当受到生长因子、细胞因子、炎症反应、血管活性物质等因素刺激时，VSMC从静止的收缩表型转变为合成表型，引发VSMC的增殖及迁移，称为表型转化，VSMC的增殖及迁移与VSMC的表型转化密切相关^[6-7]。AngⅡ作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的重要效应分子，被证实可诱导VSMC的表型转化^[8-9]。本研究使用AngⅡ刺激VSMC后，细胞增殖能力明显增强，划痕实验提示细胞迁移能力明显增强，Western blotting检测结果显示，VSMC收缩表型标志物α-SMA的表达逐渐减少，而合成表型标志物OPN蛋白的表达逐渐增加。应用TanⅡA干预AngⅡ诱导后的VSMC，随着TanⅡA浓度的增加，VSMC的增殖及迁移能力逐渐下降，同时，抑制VSMC从收缩表型转化为合成表型。

自噬可以抑制VSMC异常增殖，维持血管的正常功能，但当自噬被过度激活，会破坏胞质溶胶及细胞器，加重内皮细胞的损伤，从而引起VSMC异常增殖；当自噬水平不足，自噬缺陷会触发抗氧化反应，加速VSMC的增殖及迁移。有研究^[10]报道，在VSMC发生表型转化的过程中通常可以观察到细胞内自噬水平的改变，这表明自噬可能是VSMC发生表型转化的重要促进因子。Beclin-1、LC3A/B是2种重要的自噬相关蛋白，与自噬水平的改变呈正相关^[11]。p62是重要的自噬受体，其表达水平增高与自噬降解通路受损有关^[12]。本研究通过Western blotting检测自噬标志物，结果显示，AngⅡ可使Beclin-1、LC3A/B的蛋白表达水平升高，这表明AngⅡ诱导细胞自噬增加，当加入TanⅡA干预细胞后，AngⅡ诱导的Beclin-1、LC3A/B蛋白水平降低，提示TanⅡA可抑制AngⅡ诱导的VSMC自噬。本研究还发现AngⅡ使p62的蛋白表达水平升高，然而在加入TanⅡA干预后，同样也可逆转AngⅡ诱导的p62蛋白表达水平，这可能是由于p62除了是自噬接头蛋白之外，还是一种应激蛋白，在应激条件下（高浓度的AngⅡ环境下等）其表达水平会大幅度上升^[13]，并且自噬流出现波动时p62的变化具有一定的滞后性。应用3-MA抑制AngⅡ所诱导的自噬后，细胞的增殖及迁移能力下降，说明抑制自噬可抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖及迁移。Western blotting检测结果显示，收缩表型标志蛋白α-SMA的含量显著提升，同时合成表型标志蛋白OPN含量下降明显，提示自噬可能参与了VSMC表型转化的过程，且通过抑制自噬可以抑制AngⅡ诱导的VSMC发生表型转化。Western blotting检测还发现，3-MA处理后Beclin-1、LC3A/B表达水平均较AngⅡ干预组明显下降，由此可看出TanⅡA对AngⅡ诱导VSMC发生增殖及迁移的抑制作用与3-MA一致。

综上所述，TanⅡA可抑制AngⅡ诱导的VSMC的增殖、迁移以及表型转化，机制上可能与其下调自噬有关，TanⅡA对血管内膜增生可能具有预防作用。但本研究目前仅局限于细胞实验，后续还应结合动物实验及人体静脉组织等开展更全面的研究。