系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种全身性自身免疫病，涉及多个器官和多种自身抗体，主要影响育龄妇女。SLE患者的死亡风险比普通人群增加2.6倍。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE的主要并发症之一，是导致终末期肾病的一个重要原因，其发病率在SLE患者确诊5年内高达50%~70%^[1]。随着蛋白质组学技术的迅速发展^[2]，近年来许多学者再次将疾病的研究重点放在蛋白质上。本研究探讨了硫酸羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）治疗LN过程中肾小球内蛋白质组学的变化，为LN的早期治疗寻找生物标志物。

1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂

HCQ，购自中国康乐制药有限公司；Aurum血清蛋白小型试剂盒，购自美国Bio-Rad公司；Ettan IPGphor 3等电聚焦系统、Ettan DALTsix垂直电泳仪、Ettan spot picker全自动斑点切取系统、Typhoon Trio扫描仪、DeCyder差异分析软件购自美国GE Healthcare公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）仪，购自德国Bruker公司。

1.2 实验动物和分组

60只NZB/W F1小鼠，雌性，8周龄，SPF级，购自美国Jackson动物中心。小鼠饲养在中国医科大学动物部SPF级动物房，温度（23±3）℃，湿度（50±20）%，予以12 h交替照明。根据国家标准GB14925-2010的规定，所有小鼠均可自由进食、饮水。动物实验通过中国医科大学动物保护与使用委员会批准（编号：2019101）。

每周使用蛋白试纸（桂林优利特公司）检测新鲜尿液标本，根据尿蛋白情况监测肾脏疾病。尿蛋白10~ < 30 mg/dL，为蛋白尿±；尿蛋白30~ < 100 mg/dL，为蛋白尿+；尿蛋白100~ < 300 mg/dL，为蛋白尿2+，尿蛋白300~ < 1 000 mg/dL，为蛋白尿3+；尿蛋白≥1 000 mg/dL，为蛋白尿4+。在重复试验中，尿蛋白≥300 mg/dL，为重型LN；尿蛋白 < 300 mg/dL，为轻型LN ^[3]。在小鼠28周龄时，将40只重型LN小鼠分为HCQ组和对照组，每组20只。HCQ组给与HCQ 3 mg·kg^-1·d^-1灌胃，对照组给予等量生理盐水灌胃^[4]。

1.3 方法

1.3.1 肾小球分离

在小鼠36周龄时，1%戊巴比妥钠（30~40 mg/kg）腹腔注射麻醉。经胸主动脉灌注磁珠（美国Dynal公司）进入肾脏中，分离肾小球^[5]。采用2-D Clean-up Kit（美国GE Healthcare公司）纯化肾小球蛋白，采用2-D Quant Kit（美国GE Healthcare公司）测定蛋白含量。

1.3.2 双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluo-rescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）

蛋白质样品用CyDyes（美国GE Healthcare公司）标记。将HCQ组和对照组小鼠肾小球的可溶性蛋白质样品50 μg，分别用400 pmol的Cy3或Cy5标记。Cy2用于标记内参，内参是指所有样本等量混合后平均分至各张胶的样本量。黑暗中反应30 min，相同条件下加入1 μL赖氨酸（10 mmol/L，美国FLUKA公司）以终止反应。采用Ettan IPGphor 3进行等电聚焦程序，采用Ettan DALTsix system进行垂直电泳（12.5%SDS-PAGE）。

1.3.3 蛋白凝胶染色

采用SYPRO Ruby蛋白凝胶染色（美国Thermo Fisher公司），根据说明书操作。

1.3.4 图像采集分析

将凝胶放入Typhoon Trio扫描仪中采集图像。将图像储存在计算机内，采用DeCyder差异分析软件进行分析，将表达差异1.5倍以上的蛋白点标记为差异点。扫描每张胶上的所有蛋白点，进行胶内分析，然后将不同胶上的同一个蛋白点与内标匹配进行胶间分析，对匹配后的每个蛋白点相对量进行比较后（Cy3/Cy2或Cy5/Cy2），确定差异蛋白。

1.3.5 MALDI-TOF-MS分析

经过挖点、酶解、点靶后，采用Flex3.0软件获得蛋白质斑点的肽和指纹图谱。应用Flex3.0软件，Mascot搜索引擎，在SWISS-PROT数据库（http://www.matrixscience.com） 中检索蛋白质。

1.3.6 免疫组织化学染色

选择核糖核酸酶抑制剂（ribonuclease inhibito，RI）和α-烯醇化酶（α-enolase，ENOA）作为候选蛋白。石蜡切片脱蜡，梯度水化，高温高压修复。滴加一抗anti-RI、anti-EONA抗体（美国Santa公司），4 ℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min。100 μL DAB（北京索莱宝科技有限公司）显色，苏木素（北京索莱宝科技有限公司）复染。梯度乙醇再次脱水，中性树脂封片。

1.3.7 肾脏病理学观察

36周时处死小鼠，立即留取肾皮质，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，分别按照HE染色试剂盒（北京索莱宝试剂有限公司）、PAS染色试剂盒（北京索莱宝试剂有限公司）、Masson染色试剂盒（福州迈鑫生物科技发展有限公司）说明书进行HE、PAS、Masson染色。常规脱水、透明、中性树胶封片，在光学显微镜下观察肾皮质的病理变化。

2 结果 2.1 LN小鼠肾脏病理学变化

对照组小鼠肾脏呈现典型的弥漫增生性肾小球肾炎，肾小球系膜细胞明显增生，大量中性粒细胞浸润，系膜基质增加，甚至有部分硬化，部分区域基底膜僵硬，有局限性肾小管坏死。与对照组小鼠相比，HCQ组小鼠肾小球系膜细胞增殖减少，肾小管轻度肿胀，无变性和坏死，肾间质细胞浸润不明显。见图 1。

2.2 二维蛋白质图像分析

采用Typhoon Trio扫描仪对凝胶进行分析，获得二维差异凝胶电泳图（图 2）。

2.3 差异表达蛋白MALDI-TOF-MS鉴定

采用DeCyder软件分析每张胶，得到4 367个蛋白点，使用Ettan spot picker去除受损的胶粒。HCQ组与对照组比较，获得LDHD、VATA、FEN1、PDAI3、UTP20、ENOA、SYDC、CALU、ACTB、PNPH、SPRE、GPX3、DDX6、UBP15、CC110、TP3CL、RSSA、COPE、TPMT、DIAP3、DHRS1、PTX3、PRDX1、ATG4D共24个表达下调的蛋白和SYDC、RI、TBX6、ATG4D、PDIA1、SBP1、PSME2共7个表达上调的蛋白（蛋白表达差异1.5倍，P < 0.05）。

2.4 免疫组织化学染色检测RI和ENOA表达

免疫组织化学染色结果（图 3）显示，RI和ENOA呈棕黄色或棕褐色颗粒，在肾脏组织中均有表达。与对照组相比，治疗组小鼠肾小球内RI阳性颗粒数目多，着色明显增强，说明治疗组RI表达较对照组多；治疗组小鼠肾小球内ENOA表达阳性颗粒数目较少，着色较浅，说明治疗组ENOA表达较少。这与质谱鉴定的差异表达蛋白一致。

3 讨论

LN是SLE最严重的损害之一。体液和细胞免疫参与了LN的发病机制，包括形成免疫复合物的各种自身抗体，激活的B细胞、浸润性T细胞、巨噬细胞释放，嗜中性粒细胞失调等。近年来，随着对SLE/LN发病机制的逐渐了解，生物制剂开始被大量用于临床，但是这些疗法仅与传统疗法联合应用时才被证明有效，且这些药物的长期不良反应有待评估。

欧洲抗风湿病联盟于2019年提出治疗应以缓解或至少降低疾病活动性和预防发作为目标^[6]。所有SLE患者都应接受HCQ治疗，适当启动免疫调节剂（甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯），在持续活动性或发作性疾病中，应考虑添加生物制剂。因此，HCQ的作用备受瞩目。HCQ治疗LN的机制尚不十分明确，本研究希望通过探讨HCQ治疗前后LN小鼠肾小球蛋白质组学的变化，了解HCQ治疗LN的机制。

NZB/W F1小鼠是新西兰黑鼠和新西兰白鼠杂交子一代，自然发生免疫复合物介导的肾小球肾炎，类似于人类弥漫性增生性LN，是经典的SLE/LN动物模型。本研究采用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS蛋白质组学技术，对接受HCQ治疗的LN小鼠的肾小球蛋白质变化进行研究，共筛选出31个有统计学意义的差异蛋白。HCQ组与对照组比较，肾小球内下调蛋白24个，上调蛋白7个。同时，以RI和ENOA为候选蛋白，对肾组织进行免疫组化染色，结果与蛋白质组学分析结果一致。提示这些蛋白是LN肾小球病变发生和发展的重要因素。

ENOA最初被确定为糖酵解途径的一种成分，使用ENOA抑制剂可以减轻某些症状，如降低2型糖尿病患者的血糖、低密度脂蛋白胆固醇、纤维化和细胞凋亡^[7]。多项研究表明，20%~50%的SLE患者ENOA抗体阳性，说明SLE患者体内有ENOA抗原。BRUSCHI等^[8]通过蛋白质组学方法发现，LN患者肾脏组织中ENOA较高；未经治疗的SLE患者血清中ENOA抗体滴度和24 h尿蛋白定量高于初发患者。ENOA是一种纤溶酶原受体，能促进细胞迁移和肿瘤转移^[9]。研究^[10]发现，LN患者经过12个月的治疗，循环中ENOA抗体下降较快，且与蛋白尿减少程度平行。本研究中，HCQ治疗后小鼠肾小球内ENOA表达显著减少，这与BRUSCHI等^[8]在SLE/LN患者中发现的结果高度一致。

核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）是一类能将RNA中的核苷酸紧密结合的酶，RI通常用于阻断RNA酶的活性，如基因表达、细胞生长、分化、代谢等。因此，RI在调节RNA的寿命中起重要作用^[11]。目前，只有少数天然RI在癌症、过敏等领域被发现。人类蛋白质组分析鉴定出122种RNase。RNase与激酶、蛋白酶和表观遗传酶类似，是开发具有新机制的治疗方法的合理靶点，RI也成为改善患者预后的治疗选择^[12]。研究^[13]报道，肾盂肾炎时RI表达降低。目前，关于肾脏与RI关系的研究很少。根据RI的生理作用，推测它会影响肾脏细胞的生长、代谢、分化、细胞凋亡等。因此，它可能在SLE/LN的发生和发展中起重要作用。

综上所述，本研究采用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS蛋白质组学技术，分析HCQ治疗前后LN小鼠肾小球内蛋白质差异，这些蛋白可能是LN新的生物标志物，后续研究将进一步挖掘这些蛋白的功能和作用机制，为探讨SLE/LN的发病机制提供基础。