宫颈癌是常见的妇科肿瘤之一，也是女性癌症死亡的主要原因，严重影响女性健康。寻找潜在的标志物，有助于提高患者预后。竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）网络是指非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）通过竞争性结合微RNA（microRNA，miRNA）进而影响mRNA编码蛋白能力的调节机制^[1]，部分环状RNA（circle RNA，circRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、mRNA可竞争性结合miRNA，形成ceRNA调控网络。ceRNA网络可调控多种生物学过程，其在多种疾病特别是肿瘤中的作用已引起广泛关注^[2]。宫颈癌中circRNA-miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA-mRNA之间的ceRNA网络研究较多，但目前尚未有circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA的研究。本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库构建ceRNA网络、预后评估模型和Nomogram预测模型。

1 材料与方法 1.1 数据获取

在TCGA数据库下载RNA-seq数据，共包含309例，其中3例正常样本和306例宫颈癌样本。GEO数据库下载GSE102686、GSE44001、GSE63514、GSE9750数据，其中GSE102686包含5对宫颈癌及癌旁样本，GSE44001包含300例宫颈鳞癌样本，GSE63514包含24例正常样本和28例宫颈癌样本，GSE9750包含24例正常样本和33例宫颈癌样本。

应用R语言中的“edgeR”包筛选TCGA数据库中宫颈癌样本及正常样本中的差异表达（differential expression，DE）lncRNAs、DEmRNAs（|log₂FC| > 2，校正P < 0.01）。采用在线工具GEO2R筛选GSE102686中的DEcircRNAs（|log₂FC| > 1，校正P < 0.05）。

1.2 靶向关系预测

采用miRcode数据库^[3]预测DElncRNAs靶向的miRNAs。使用CircBase数据库^[4]进行DEcircRNAs的ID转换。使用CircBank数据库^[5]预测DEcircRNAs靶向的miRNAs。使用Targetscan数据库^[6]预测miRNAs靶向的mRNAs。使用Cystoscape软件^[7]进行数据可视化。

1.3 预后模型构建

采用单因素Cox分析、LASSO分析及多因素Cox分析进而确定核心mRNAs。继而使用“Survminer”包计算最佳临界值，将样本分为高危组和低危组。通过使用“survival”包进行K-M生存分析，使用“survival ROC”包构建受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。同时使用GSE44001数据进行外部验证。

1.4 Nomogram构建

采用“rms”包对TCGA数据库进行Nomogram预后模型构建。患者的1、3、5、10年生存率及复发率可通过模型预测。使用校准曲线以及C指数显示此预后模型的准确性。

1.5 实时PCR

收集2021年至2023年新疆医科大学第一附属医院病理科宫颈癌组织和正常宫颈组织各6例。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（S220120-20），患者均知情同意。

采用TRIzol试剂（美国赛默飞世尔科技有限公司）从组织中提取总RNA，并使用PrimeScript^® RT试剂盒（中国宝日医生物技术有限公司）进行逆转录。实时PCR在QuantStudio™ 1 Plus实时PCR检测系统（美国赛默飞世尔科技有限公司）上进行，使用SYBR Green Supermix试剂盒（中国宝日医生物技术有限公司）按照说明书进行操作。引物序列如下：GTPBP2，正向5’-TGTTCCATGCCACCACCTTCC-3’，反向5’-CCACTGCCTTCTCGCCTGTC-3’；HELLS，正向5’-TTTCAACAACCAAAGCACTTCACTG-3’，反向5’-TTCCCAAAGCATCCTAAGCCATTC-3’；ROR1，正向5’-ACCGCACCGTCTATATGGAGTC-3’，反向5’-AAGGAATGGCGAACTGAGAACAC-3’；HLF，正向5’-AAGAGAACCAGATCGCCATCCG-3’，反向5’-CCTTCCTCAAGTCAGCCACCTC-3’；SBDS，正向5’-CAACCAGATCCGCCTAACCAATG-3’，反向5’-CGCCAGCCGACGACCTTG-3’。

2 结果 2.1 筛选DElncRNAs、DEmRNAs和DEcircRNAs

TCGA数据库共筛选出634个DElncRNAs，其中，上调基因491个，下调基因143个（图 1A）；2 618个DEmRNAs，其中，上调基因1 585个，下调基因1 033个（图 1B）。GSE102686数据集中筛选出175个DEcircRNAs，其中，上调基因64个，下调基因111个（图 1C）。

2.2 预测DElncRNAs和DEcircRNAs靶向的miRNAs

miRcode数据库预测发现30个DElncRNA和206个miRNA之间存在靶向关系；CircBank数据库鉴定出173个DEcircRNA和2 365个miRNA之间存在靶向关系。将DElncRNAs和DEcircRNAs靶向的miRNAs进行交集分析得到49个miRNA，见图 2。

2.3 预测miRNA靶向的mRNA并与DEmRNAs进行交集分析

Targetscan数据库预测出836个mRNA。将miRNA靶向的mRNA和DEmRNAs进行交集分析得到138个mRNA，见图 3。

2.4 构建预后模型

通过单因素Cox回归分析筛选出15个mRNA；进一步进行LASSO回归鉴定得出8个mRNA（图 4），经过多因素Cox回归选择5个mRNA进行预后模型构建（表 1）。5个mRNA分别为GTPBP2、HELLS、ROR1、HLF和SBDS。

根据最佳截断值，将样本分为高危组和低危组并进行K-M生存分析（图 5A），结果显示2组患者的生存率有统计学差异（P < 0.05）。为验证模型的准确性，使用ROC曲线进行评估预后模型的准确性，1年、2年、3年总生存期（overall survival，OS）预测风险评分的曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.71、0.71、0.70（图 5B），说明该预后模型具有较高的灵敏度和特异度。

与此同时，使用GSE44001数据集进行预后模型的外部验证。根据最佳截断值，将样本分为高危组和低危组并进行K-M生存分析（图 5C），结果显示，2组患者的生存率有统计学差异（P < 0.05）。1年、2年、3年OS预测风险评分的AUC分别为0.64、0.64、0.60（图 5D）。

2.5 Nomogram模型构建

基于风险评分、figo分期、T分期、是否原发等独立预测因素，构建OS预测的个体化预测模型（图 6A）。采用个体化预测模型可估计宫颈癌患者（1、2、3、5和10年）的生存率。校准曲线中的Nomogram和实际观测结果显示出良好的重叠，表明其具有最佳的预测精度（图 6B）。该Nomogram模型的C指数为0.707，高于其他预测模型（图 6C）。

2.6 构建circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络

根据ceRNA网络中的上述关系，共构建了包含5个mRNA、12个miRNA、27个lncRNA和39个circRNA的预后circRNA-lncRNAmiRNA-mRNA ceRNA网络。

2.7 实时PCR验证核心mRNA的表达

采用实时荧光定量PCR技术检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中核心mRNA的表达差异（图 7），结果发现GTPBP2和HELLS在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，ROR1、HLF和SBDS在宫颈癌组织的表达显著低于正常宫颈组织（P < 0.05）。

3 讨论

宫颈癌是全球第四大常见癌症，同时也是女性死亡的第四大原因^[8]。宫颈癌的发病机制复杂，就诊时多处于中晚期，常伴有肺转移，预后较差，目前仍缺乏可靠的预后预测指标。因此，了解宫颈癌的异常基因表达调控网络，寻找可能的预后标志物，对实现早期诊断和治疗至关重要。

ncRNAs可调控基因表达并参与炎症反应等生物学过程^[9]，在肿瘤领域受到越来越多的关注，例如肝细胞癌^[10]、非小细胞肺癌^[11]、宫颈癌^[12]等。ceRNA调控网络理论指出，ncRNAs具有共同的miRNA应答元件（microRNA response element，MRE）能够竞争性结合miRNA，并达到互相调控的效果^[13]。然而，以往关于宫颈癌ceRNA调控网络的研究仅探讨了circRNA^[14]和lncRNA^[15]的作用，尚未同时全面筛选circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA构建宫颈癌预后的ceRNA网络。本研究分析了多个数据库，并通过多次筛选和验证，建立了枢纽式预后ceRNA调控网络。

本研究采用TCGA和GEO数据库筛选了差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA。随后根据lncRNA-miRNA、circRNA-miRNA和miRNA-mRNA之间的靶向关系，通过单因素Cox、LASSO回归、多因素Cox进一步筛选出5个生存相关的核心mRNA，构建了宫颈癌预后模型。本研究以5种mRNA（GTPBP2、HELLS、ROR1、HLF、SBDS）为核心基础，构建更全面的与circRNA、lncRNA、miRNA、mRNA相关的ceRNA调控网络，可作为宫颈癌预后的生物标志物。

为验证核心mRNA在宫颈癌中的表达差异，本研究利用实时PCR检测临床组织样本中mRNA的表达，结果显示，5种核心mRNA在宫颈癌组织和正常宫颈组织中存在表达差异，此结果与前期数据库结果一致。后续将进行核心mRNA在宫颈癌中的功能验证及基础实验探讨核心mRNA在宫颈癌中的具体作用及机制。

宫颈癌患者早期复发的监测对临床实践具有重要意义。如果能够构建个体化的早期复发预测模型，并具有较高的准确性，就有可能做出更好的临床决策，从而改善患者的预后。为促进预后模型的临床应用，本研究构建了Nomogram预测模型。由于Nomogram模型中其他预测因素为常规检查项目，因此该预测模型具有一定的适用性。

综上所述，本研究首次构建了宫颈癌的circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络及个体化预测模型，可为临床患者预后及个体化诊疗护理提供新的理论依据。