2024, Vol. 53文章信息
- 阮绥鑫, 李良, 陈静
- RUAN Suixin, LI Liang, CHEN Jing
- 核因子κB和白细胞介素-6在放射性膀胱损伤中的表达及意义
- Expression and significance of nuclear factor-κB and interleukin-6 in radiation-induced bladder injury
- 中国医科大学学报, 2024, 53(4): 332-336
- Journal of China Medical University, 2024, 53(4): 332-336
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文章历史
- 收稿日期：2023-05-16
- 网络出版时间：2024-04-10 18:00:32
引用本文 |
2. 锦州医科大学附属第三医院泌尿科，辽宁 锦州 121000;
3. 锦州医科大学附属第一医院日间化疗中心，辽宁 锦州 121000
2. Department of Urology, The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China;
3. Day Chemotherapy Center, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China
放射性膀胱损伤是腹腔、盆腔恶性肿瘤患者接受放射治疗后的常见并发症，以早期的膀胱炎症和后期的膀胱出血、纤维化为主要特征。目前，仍缺乏针对放射性膀胱损伤的有效治疗手段。近年来，研究[1]发现多种细胞因子参与放射性膀胱损伤病变的形成和进展。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是近年关注的与细胞增殖、损伤和炎症反应形成相关的因子，不仅在肿瘤性增生中发挥重要作用，在放射性损伤及继发的炎症损伤中的作用也较明显[2]。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是促炎性细胞因子和免疫介导因子，参与炎症反应形成中的瀑布效应。研究[3]显示，NF-κB与IL-6可能具有协同作用。本研究通过观察放射性膀胱损伤的病变特征，分析NF-κB与IL-6的关系，为研究放射性膀胱损伤的形成机制和防治提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1，购于中国科学院上海细胞库。雄性成年SD大鼠20只，体重180~220 g，由我院实验动物中心提供，标准颗粒喂养，自由取食，饮水不限。本研究获得锦州医科大学实验动物伦理委员会批准。
1.2 方法 1.2.1 细胞分组取出液氮中冻存的SV-HUC-1细胞，置于37 ℃水浴锅中晃动融化后，乙醇消毒。将液体倒入含有10 mL培养基的离心管中，应用DMEM培养基+10%胎牛血清在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞复苏呈贴壁生长，状态良好。分别应用5、10和15 Gy的X线照射SV-HUC-1细胞24、48和72 h，将未行照射的SV-HUC-1细胞作为正常对照组。
应用Lipofectamine 3000（美国赛默飞世尔科技公司）将siRNA-NF-κB质粒（上海碧云天公司合成）转染至15 Gy X线照射72 h后的细胞株，建立siRNA-NF-κB组（si-NF-κB组），将未转染质粒的15 Gy X线照射72 h后的细胞株作为空白对照组。
1.2.2 细胞增殖活性的检测选择si-NF-κB组和空白对照组的细胞株制成细胞悬液，调整细胞密度为3.0×104/mL。96孔板孔内接种100 μL细胞悬液（约3.0×103个细胞），每组3个复孔。在24、48、72 h时分别加入CCK-8试剂10 μL（上海生工生物公司），1 h后用酶标仪（美国Thermo公司）测定各孔在450 nm处的吸光度值。
1.2.3 NF-κB和IL-6 mRNA表达的检测应用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测NF-κB和IL-6 mRNA。TRIzol抽提总RNA，逆转录获取cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列：NF-κB，正向5’-CGAACTGTGTGGTTACTCCCTA-3’，反向5’-CAACGTCCGTCCTAGACTGCGT-3’；IL-6，正向5’-CACTGTGCACGTCACCGGTGTAACTA-3’，反向5’-CAATCACGTGTGTGGTTATCCCGT-3’；以U6为内参，正向5’-CTGATTTTACTCCCCTGACTG-3’，反向5’-GATCGGGTTTCCCGCAAGCT-3’。扩增程序：5 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。以2-ΔΔCt计算NF-κB和IL-6mRNA的表达量。ΔΔCt = [Ct目的基因（未知样品）-Ct对照（未知样品）]-[Ct目的基因（校正样品）-Ct对照（校正样品）]。
1.2.4 IL-6蛋白的检测应用Western blotting检测IL-6蛋白。IL-6浓缩液购自武汉博士德生物工程有限公司，IL-6稀释浓度为1∶2 000，内参为β-actin（稀释浓度为1∶2 000）。按说明书操作，经湿转法转到PVDF膜，显影。应用ImageJ软件行灰度分析，对目的蛋白与β-actin的比值进行半定量分析。
1.2.5 放射性膀胱损伤大鼠模型的建立和分组将20只雄性SD大鼠随机分为模型组和对照组，每组10只。模型组建立放射性膀胱损伤模型。大鼠用10%水合氯醛溶液（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，采用钴60治疗机进行全膀胱区单次照射（照射野大小约2 cm×3 cm），一次性给予，剂量为20 Gy。铅块遮挡其余部位，照射后在温暖动物箱中复苏。于照射后第2周处死大鼠。对照组大鼠麻醉方法同模型组，放入机房而不进行照射。之后与模型组大鼠同时置于动物箱中，2周后处死。切取2组大鼠的膀胱组织，一部分立即置于-80 ℃冰箱中冻存待检，一部分制作石蜡包埋组织。
1.2.6 HE染色观察放射性膀胱损伤的病变特征应用HE染色观察膀胱的病变特征，石蜡包埋组织，脱蜡、染色、透明后封片。细胞核显色为蓝色，细胞质显色为红色。
1.3 统计学分析应用SAS 6.12软件处理数据。符合正态分布的计量资料以x±s表示，先行方差齐性检测和正态性检验，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，并应用SNK法进行两两比较。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析应用线性相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 X线具有剂量和时间依赖性细胞毒性与正常对照组比较，SV-HUC-1细胞在应用5、10和15 Gy的X线照射48和72 h时细胞增殖活性均明显下降（P < 0.05），其中15 Gy的X线照射72 h时下降最明显。见表 1。
| Time point | Cell proliferative activity | F | P | NF-κB mRNA | F | P | IL-6 mRNA | F | P |
| 24 h | 0.82 | 0.413 | 0.18 | 0.910 | 0.05 | 0.985 | |||
| Normal control group | 1.00±0.02 | 1.02±0.12 | 1.01±0.02 | ||||||
| 5 Gy irradiation group | 0.98±0.03 | 1.08±0.13 | 1.04±0.16 | ||||||
| 10 Gy irradiation group | 0.95±0.05 | 1.09±0.14 | 1.05±0.17 | ||||||
| 15 Gy irradiation group | 0.90±0.08 | 1.05±0.11 | 1.06±0.18 | ||||||
| 48 h | 4.34 | 0.043 | 5.43 | 0.025 | 27.00 | < 0.001 | |||
| Normal control group | 1.00±0.04 | 1.03±0.13 | 1.02±0.04 | ||||||
| 5 Gy irradiation group | 0.80±0.121） | 1.23±0.111） | 1.31±0.041） | ||||||
| 10 Gy irradiation group | 0.75±0.111） | 1.24±0.021） | 1.34±0.091） | ||||||
| 15 Gy irradiation group | 0.71±0.131） | 1.29±0.051） | 1.43±0.071） | ||||||
| 72 h | 60.86 | < 0.001 | 5.94 | 0.020 | 5.73 | 0.022 | |||
| Normal control group | 1.00±0.03 | 1.04±0.13 | 1.03±0.03 | ||||||
| 5 Gy irradiation group | 0.42±0.131） | 1.42±0.221） | 1.67±0.28 | ||||||
| 10 Gy irradiation group | 0.34±0.051），2） | 1.65±0.311），2） | 1.85±0.371），2） | ||||||
| 15 Gy irradiation group | 0.23±0.061），2），3） | 1.89±0.321），2），3） | 1.97±0.391），2），3） | ||||||
| 1）P < 0.05 vs. normal control group；2）P < 0.05 vs. 5 Gy irradiation group；3）P < 0.05 vs. 10 Gy irradiation group. | |||||||||
2.2 不同时点和不同剂量X线照射后细胞中NF-κB和IL-6 mRNA表达的比较
与正常对照组比较，SV-HUC-1细胞在应用5、10和15 Gy的X线照射48和72 h时NF-κB和IL-6 mRNA表达均明显升高（P < 0.05），其中15 Gy X线照射72 h时升高最明显。见表 1。
2.3 siRNA-NF-κB转染后细胞中IL-6蛋白的表达Western blotting结果显示，与空白对照组（1.32±0.21）比较，si-NF-κB组（15 Gy的X线照射72 h）细胞中IL-6蛋白的表达（0.96±0.10）明显下降（P < 0.05）。见图 1。
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| 图 1 2组细胞中IL-6蛋白的表达 Fig.1 Comparison of IL-6 protein expression in cells between the two groups |
2.4 放射性膀胱损伤大鼠模型的病变特征
模型组大鼠膀胱黏膜表面的伞细胞脱落，部分尿路上皮脱失，间质成纤维细胞增生，伴淋巴细胞、浆细胞和少许中性粒细胞浸润，部分区域伴水肿，小血管增生。对照组大鼠的正常膀胱黏膜组织中，可见黏膜组织中尿路上皮层次明显，表面可见伞细胞，黏膜下层组织疏松，炎症细胞极少。见图 2。
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| 图 2 2组大鼠膀胱黏膜HE染色结果 Fig.2 Images of HE-stained tissue sections of rat urinary bladder mucosa |
2.5 大鼠膀胱组织中NF-κB和IL-6 mRNA表达
模型组大鼠膀胱组织中NF-κB和IL-6 mRNA的表达明显高于对照组（P < 0.05）。见表 2。
| Item | Model group（n = 10） | Control group（n = 10） | t | P |
| NF-κB mRNA | 2.31±0.25 | 1.02±0.15 | 13.91 | < 0.001 |
| IL-6 mRNA | 2.65±0.42 | 1.44±0.23 | 8.00 | < 0.001 |
2.6 放射性膀胱损伤大鼠膀胱组织中NF-κB和IL-6 mRNA表达的相关性
线性相关分析结果显示，放射性膀胱损伤大鼠膀胱组织中NF-κB和IL-6 mRNA的表达呈正相关（P < 0.05）。见图 3。
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| 图 3 放射性膀胱损伤大鼠膀胱组织中NF-κB和IL-6 mRNA表达的相关性 Fig.3 Correlation of NF-κB and IL-6 mRNA expression in urinary bladder tissues of rats with radiation-induced bladder injury |
3 讨论
电离辐射广泛用于临床和基础研究领域，机体组织在电离辐射时发生不同程度的损伤。肿瘤放射治疗是应用放射线治疗肿瘤的方法，对盆腔和腹部肿瘤进行局部治疗时易引起膀胱损伤。放射性膀胱损伤常发生在早期阶段[4]。近年来，学者发现多个与损伤相关的因子，其中包括NF-κB。研究发现，NF-κB在放射性肺损伤[5]、放射性胰腺损伤[6]的病变组织中表达均升高，并在血管内皮细胞和上皮细胞中能检测到NF-κB少量表达，放射线刺激诱导的放射性损伤组织也能产生一定量的NF-κB[7]。也有研究[8]发现微生物和促炎性细胞因子均能引起NF-κB活化，这种活化作用与IκB激酶的磷酸化和泛素化降解过程相关，活化后的NF-κB诱导下游的多个靶基因发挥生物学作用。也有研究[9]认为，NF-κB可能是白细胞介素家族重要的诱导因子，是一种控制编码细胞因子的转录因子。
本研究结果显示，尿路上皮细胞的增殖活性随着X线剂量和照射时间的增加而降低，提示电离辐射对细胞增殖有明显的抑制作用，这是膀胱黏膜损伤的重要的机制。本研究发现，NF-κB和IL-6 mRNA表达随着X线剂量和照射时间的增加而增加，且二者具有靶向调控作用，共同作用在损伤过程中。放射性膀胱损伤大鼠模型的膀胱病变组织中能观察到典型的损伤形成，由于膀胱黏膜和伞细胞脱落[10]，黏膜下层裸露，间质成纤维细胞表现出修复性增生，同时伴有明显的放射性炎性病变，表现为淋巴细胞、浆细胞和少许中性粒细胞浸润，部分区域伴水肿[11-12]。本研究的动物实验结果显示，大鼠膀胱病变组织中NF-κB和IL-6 mRNA高表达，且呈正相关性。不仅证实了NF-κB和IL-6在损伤性病变中的特征，还间接验证了二者的靶向关系。NF-κB可能是IL-6的上游因子，活化后表达为持续性炎症损伤，同时伴有修复性改变。也有研究[3]认为，IL-6能刺激NF-κB信号通路活化，通过信号转导途径，引起抑制性κB蛋白解离[3]，NF-κB发生核易位，进入细胞核与靶因子嵌合，激活靶因子的转录活性。因此，二者可能是环状循环。NF-κB可能是更核心的因子，活化后的NF-κB具有以下功能：（1）促使巨噬细胞产生血小板源性生长因子、肿瘤坏死因子和多种白细胞介素家族因子，促进炎性渗出和聚集[13]；（2）引起成纤维细胞分裂、繁殖和增生；（3）促进成纤维细胞胶原化[14-15]；（4）促进黏膜下间质水肿的形成。
综上所述，X线对膀胱的损伤具有浓度和时间依赖性细胞毒性，病变形成过程中NF-κB和IL-6的表达升高且具有协同作用。但是，NF-κB和IL-6调控的具体生物学特性还需后续研究进一步明确。
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