阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）作为一种慢性神经系统变性疾病，发病率逐年上升 ^[1]。AD以其特有的认知功能渐进性恶化为显著特征，最终导致患者记忆丧失、思维混乱，严重损害其日常生活功能。β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）与AD的发病紧密相关，并可能通过诱导细胞衰老等机制加剧其病理变化^[2]。

随着年龄的增长，脑组织中会出现一系列与AD相关的病理现象，其中Aβ的沉积尤为显著。同时，衰老的神经细胞周围普遍存在着微管相关蛋白tau神经纤维缠结等特征，这些变化都大大增加了AD的发生率^[3]。衰老是一个由生物、化学或物理过程的负面后果介导的复杂过程，其中一个重要的表现为分子损伤的积累。在机体的衰老过程中，脑衰老表现得尤为突出，而这一过程常伴随着AD发生率的增加^[4]。为了更准确地评估衰老状况及其与AD的关系，研究者们提出了多种指标，如衰老细胞的比例以及氧化应激水平等，为深入研究AD的发病机制和寻找有效的治疗方法提供了新的思路^[5]。

前期研究^[6]显示，Aβ3-10KLH多肽疫苗能够诱导产生高浓度的抗Aβ抗体，有效清除Aβ斑块，减轻脑组织的炎症反应，并对突触产生保护作用。SAMP8小鼠是从AKR/J品系中精心培育出的快速衰老模型，能够自发地模拟出与AD相关的病理改变。本研究旨在探讨Aβ3-10KLH疫苗在延缓SAMP8小鼠脑衰老中的作用，为后期的临床试验提供实验支持。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

3月龄的雄性SAMP8小鼠和雄性SAMR1小鼠均购自江苏华创信诺医药科技有限公司。提供足量无菌饲料和饮水，小鼠饲养的条件温度为（22±2）℃，湿度为45%~65%，12 h的昼夜交替。其中，光照期发生在7：00~19：00，适应性饲养时间为1周。本研究经中国医科大学动物伦理委员会批准（CMU2023006）。

1.1.2 主要试剂及仪器

Aβ3-10KLH多肽疫苗委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其氨基酸序列为EFRHDSGY。疫苗通过固相合成法及高效液相色谱法纯化，纯度达到96.2%，并通过质谱法验证其相对分子质量为1 113.17。在合成多肽的C端添加一个半胱氨酸用于偶联血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）。弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司，衰老细胞β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色试剂盒购自武汉谷歌生物科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，水迷宫仪器购自上海欣软信息科技有限公司，包埋机购自武汉俊杰电子有限公司，冰冻切片机购自美国Thermo Fisher Scientific公司，组织摊片机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，显微镜购自日本Nikon公司，石蜡切片机购自德国Leica公司，酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，离心机购自德国Eppendorf公司。

1.2 分组

将3月龄雄性小鼠分为SAMR1组、SAMP8组和SAMP8+Aβ3-10KLH组。SAMR1组和SAMP8组注射PBS缓冲液100 μL，SAMP8+Aβ3-10KLH组注射Aβ3-10KLH疫苗溶液100 μL，浓度为1 μg/μL^[6]。各组均为颈项部皮下注射，注射间隔为14 d，共注射10次。

1.3 Morris水迷宫检测小鼠的认知功能

水迷宫为圆形水池，直径1.2 m，水深0.37 m，水温22 ℃。水池分为4个象限，透明隐藏平台设置在东南象限。实验分为熟悉训练、定位航行实验和空间探索实验3个阶段。熟悉训练旨在让小鼠熟悉水池环境；定位航行实验持续5 d，评估小鼠的空间学习能力，记录其到达平台的时间；空间探索实验于第6天进行，分析小鼠在无平台情况下的游泳轨迹，评估其记忆能力。若小鼠在90 s内未找到平台，实验结束，引导其上平台休息，并对小鼠在各象限停留时间和路线进行分析。

1.4 HE染色检测海马区神经组织

4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（厚4 μm），烤片，脱蜡再水化，Harris苏木素染色6 min，分化反蓝，伊红染色3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.5 SA-β-gal染色检测小鼠海马组织衰老细胞比例

按照说明书配置工作液，取小鼠脑组织泳冻切片自然晾干，固定20 min后用SA-β-gal染色液染色，置于PBS缓冲液中浸洗。切片充分染色，在37 ℃闭光湿箱中孵化18 h。显色后弃染液，用PBS缓冲液和纯水浸洗。核固红染液染色3 min，流水冲洗。切片经无水乙醇脱水、二甲苯透明后封片。衰老细胞胞质呈蓝色，细胞核呈红色。使用显微镜观察海马组织中衰老细胞的比例，并通过ImageJ软件扫描积分光密度（integral optical density，IOD）值进行计算。

1.6 MDA试剂盒检测海马组织MDA浓度

准确称取10 mg海马组织样本，加入适量的裂解液在低温的条件下组织匀浆，12 000 r/min冷冻离心5 min。收集上清后检测每个样本的蛋白浓度。分别配置MDA检测工作液和TBA储存液，稀释标准品及样品测定按照试剂盒说明书操作。使用酶标仪在波长532 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算浓度。

1.7 SOD试剂盒检测海马组织SOD活性

海马组织匀浆后上清蛋白定量，样本检测按照试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度。根据公式计算样本中的SOD活性。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0.3软件进行统计分析，数据以x±s表示。行为学数据采用重复测量方差分析，其余数据采用单因素方差分析，并用Tukey’s进行事后检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Aβ3-10KLH疫苗改善SAMP8小鼠的认知功能

在定位航行实验阶段，随着训练天数的增加，3组小鼠找到平台的时间均变短，但组间比较无统计学差异（P > 0.05），见表 1。在空间探索实验阶段，与SAMR1组小鼠对比，SAMP8组和SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠在目标象限的停留时间均有所下降（P < 0.05）；而与SAMP8组小鼠相比，SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠在目标象限的停留时间则显著延长（P < 0.05），见表 2。结果表明，与SAMR1组相比，SAMP8组和SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠的记忆能力均有所下降（P < 0.05）；而SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠的记忆能力较SAMP8组小鼠有所提高（P < 0.05）。

2.2 Aβ3-10KLH改善海马区神经细胞形态

HE染色结果显示，SAMR1组小鼠海马CA1区可见排列紧密且形态规整的神经细胞，细胞质清晰、细胞核可见。SAMP8组小鼠海马CA1区神经细胞形态受损，排列松散，部分细胞出现核固缩现象。与SAMP8组小鼠相比，SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠则表现出明显的改善，小鼠海马CA1区神经细胞排列更为有序，且核固缩现象显著减少。见图 1。

2.3 Aβ3-10KLH减少SAMP8小鼠海马组织中衰老细胞比例

SA-β-gal染色观察3组小鼠海马组织阳性着色的衰老细胞比例结果显示，与SAMR1组比较，SAMP8组衰老细胞比例明显增加（P < 0.05），可以观察到明显的被染成蓝色的阳性着色衰老细胞。与SAMP8组比较，SAMP8+Aβ3-10KLH组海马组织中衰老细胞的比例减少（P < 0.05）。见图 2。

2.4 Aβ3-10KLH减轻SAMP8小鼠海马组织中的氧化应激损伤

与SAMP1组小鼠相比，SAMP8组和SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠海马细胞内MDA浓度增加，SOD活性降低。与SAMP8组小鼠相比，SAMP8+Aβ3-10KLH组小鼠海马细胞内MDA浓度显著降低（P < 0.05），SOD活性明显增加（P < 0.05），见表 3。

3 讨论

AD是一种进行性的神经系统变性疾病，对患者的日常生活和社交能力造成了严重的影响。随着AD病情的恶化，患者可能会出现行为异常、情绪波动以及睡眠障碍等症状 ^[7]。目前，AD的病因尚未确定，但遗传、环境和年龄等可能是其发病的重要因素。神经细胞衰老作为AD病理过程中的一个核心环节，与患者认知能力的下降密切相关^[8]。因此，研究神经细胞衰老对于揭示AD的发病机制具有重要的意义。

本研究观察到AD模型SAMP8小鼠海马组织中出现了核固缩现象，衰老细胞比例明显增加，并且MDA含量增高，这进一步证实了衰老在AD发病过程中的重要作用。海马是大脑中与学习、记忆和情感等高级功能密切相关的关键区域，在AD的发展中往往最早受到影响^[9]。研究^[10]显示，诱发细胞衰老的主要因素之一是高水平的活性氧，而在AD的早期即可观察到氧化应激的特征。Aβ3-10KLH疫苗能够减少SAMP8小鼠海马组织中MDA的生成，提高SOD的活性。MDA是脂质过氧化的副产物，在神经退行性疾病中常常升高，提示存在氧化损伤^[11]，而SOD则是一种重要的抗氧化防御机制^[12]。因此，Aβ3-10KLH疫苗可能通过特定信号通路增强抗氧化剂，从而减轻与衰老神经细胞相关的氧化应激，发挥其有益作用。

空间探索实验结果显示，应用Aβ3-10KLH后SAMP8小鼠的记忆能力有所提升，这表明Aβ3-10KLH能够减缓SAMP8小鼠认知功能的退化，有效提高小鼠的认知功能。此外，Aβ3-10KLH疫苗还能改善SAMP8小鼠的神经细胞形态，减少海马区神经细胞的核固缩现象。通过SA-β-gal染色观察海马组织的衰老细胞，发现Aβ3-10KLH疫苗能降低SAMP8小鼠海马区衰老细胞的比例。

综上所述，本研究中Aβ3-10KLH疫苗能够降低海马组织衰老细胞比例、抑制氧化应激损伤，并延缓神经细胞衰老过程。尽管Aβ3-10KLH疫苗在延缓脑衰老方面的潜力已初步显现，但其具体作用机制，特别是与免疫系统的相互作用及调节氧化应激的途径，仍有待深入探讨。未来的研究将致力于阐明相关机制，以期为该疫苗在AD预防和治疗中的应用提供坚实的理论基础和新的策略方向。