电压门控钙通道（voltage gated calcium channel，VGCC）是细胞内Ca²⁺内流的最主要途径，介导细胞内多种Ca²⁺依赖性调控过程的发生，如兴奋产生、肌肉收缩、激素和神经递质的分泌及基因表达等^[1-3]。VGCC受2种钙调蛋白（calmodulin，CaM）介导的Ca²⁺依赖性的反馈机制调节，即Ca²⁺依赖性易化（Ca²⁺-dependent facilitation，CDF）和Ca²⁺依赖性失活（Ca²⁺-dependent inactivation，CDI）过程，从而维持细胞内钙稳态^[4-10]。对于心肌CaV1.2钙通道，CaM的结合位点包括位于通道C末端的IQ和preIQ基序，Ⅰ-Ⅱ环以及通道N末端^[9-11]。近期研究^[12-16]表明一系列CaM关键结构域内位点突变引发可伴随心源性猝死的长QT综合征（long QT syndrome，LQTS），有研究^[12-17]表明这可能与CaM突变后改变与CaV钙通道作用引发CDI异常有关。

CaM是主要的Ca²⁺传感器之一，为哑铃形构象，有2个球形末端[N末端片段（N-terminal lobe，N-lobe；a.a. 3-81）和C末端片段（C-terminal lobe，C-lobe；a.a.77-149）]，两端结构域有48%相同序列和75%同源序列^[18]。N-lobe和C-lobe虽然结构相似，但两端的不同序列也决定了它们对Ca²⁺的亲和力不同，与CaV钙通道上不同结合位点的亲和力也不同，两者对CaV钙通道起到特异性调节作用^[19-21]。有趣的是，全外显子组测序相继发现的与LQTS相关的多种CaM致病突变体均位于CaM的C-lobe上，这可能与N-lobe和C-lobe对CaVs钙通道调节的特异性有关，但具体机制尚不明确。

本研究首次构建LQTS相关CaM突变体E141G的C-lobe（C-lobe of CaM mutant E141G，C-lobe_E141G），以排除CaM的N-lobe对通道的调节，可清晰观察突变对CaM的C-lobe作用的影响，旨在阐明突变对CaM的C-lobe特异性调节CaV钙通道的影响，进而为CaM的C-lobe突变引发的LQTS的发生机制的研究提供材料基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料和动物

pGEX-6p-3/C-lobe质粒由日本鹿儿岛大学KAMEYAMA教授惠赠，pGEX-6p-3/C-lobe_E141G由江苏溥博生物科技有限公司以C-lobe为模版采用点突变试剂盒制备。6~8周龄、体重220~320 g的SD大鼠由中国医科大学实验动物部提供。动物饲养和实验原则遵照《中国医科大学实验动物福利与伦理审查委员会规定》进行。

1.2 方法

1.2.1 质粒的转化及鉴定

取大肠杆菌BL21感受态细胞100 μL，加入pGEX-6p-3/C-lobe_E141G质粒10 ng，冰中放置30 min后于42 ℃水浴中精确热击60 s，然后快速转移至冰中冷却2 min，加入预热好的37 ℃ SOC培养基1 mL，37 ℃摇震荡培养1 h，4 000 r/min离心2 min后吸除部分上清培养液，剩余约200 μL培养液重悬菌体，均匀涂布在含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的琼脂平板培养基37 ℃过夜筛选。挑取单克隆菌种接种于装有LB培养液（含氨苄青霉素0.05 mg/mL）的试管中震摇培养12~16 h，采用碱裂解法提取质粒。质粒经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，并进行DNA测序，鉴定质粒。

1.2.2 融合蛋白的表达及纯化

取适量pGEX-6p-3/C-lobe_E141G重组质粒转化BL21菌种，加入装有400 mL LB培养液（含AMP 50 μg/mL）的锥形瓶中，在37 ℃水浴锅中以120 r/min速度震摇培养12~16 h。当波长595时的吸光度（A595）值达到0.6~1.0时，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl thiobeta-D galactoside，IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃、120 r/min条件下诱导谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）-C-lobe_E141G融合蛋白表达4 h。菌液以5 000 r/min、4 ℃离心10 min后弃上清，用20 mL PBS重悬沉淀菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.1 mg/mL，冰浴处理30 min。在冰浴中以200 W、超声3 s间隔7 s的条件共超声20 min，打破菌体后4 ℃、16 000 r/min离心10 min。收集上清与两管300 μL GS-4B beads混合后置10 r/min的旋转培养器4 ℃旋转过夜。PBS清洗3次后每管加入495 μL PBS和5 μL蛋白酶切酶，混匀后室温剧烈震摇酶切GST标签5 h。600 r/min，离心3 min，收集上清即获得目的蛋白C-lobe_E141G，并于-20 ℃冻存。

preIQ重组质粒经LB培养基培养后，IPTG诱导GST融合蛋白表达，采用GS-4B beads进行分离纯化后得到GST-preIQ融合蛋白^[20]。

1.2.3 蛋白的纯度鉴定及浓度测定

常规15% SDS-PAGE电泳检测纯化后的C-lobe_E141G蛋白纯度及相对分子量。参照BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定纯化后的C-lobe_E141G蛋白浓度。

1.2.4 GST pull-down实验

取连接于GS-4B beads上的GST-preIQ融合蛋白40 μL于2 mL EP管中，加入C-lobe_E141G使其终浓度分别为0.1、0.35、0.7、1.4、2.1、3.5 μmol/L，加入[Ca²⁺]为2 mmol/L的Tris缓冲液至总体系为300 μL。4 ℃低转速旋转孵育4 h。800 r/min4 ℃离心3 min。弃掉上清后取Tris缓冲液300 μL，800 r/min 4 ℃轻柔清洗2次，每管加入15 μL 1×SDS样品缓冲液洗脱。取上清，采用常规15% SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白。

1.2.5 单个大鼠心室肌细胞的制备

SD大鼠经苯巴比妥腹腔注射麻醉后，在人工呼吸机支持下进行主动脉插管，分离心脏。然后利用Langendorff灌流装置，采用胶原酶消化大鼠心室肌细胞来获得单个心肌细胞。

1.2.6 单通道钙电流的检测

应用膜片钳单通道记录模式监测钙通道活性。首先形成细胞贴附模式，然后将膜片自细胞游离建立膜内面向外模式，再将膜片小心移动入浴槽旁边充满测试溶液的凹槽中。用pClamp10.2软件记录和分析数据，由于I = N×Po×i，测定实验脉冲开始后5~105 ms期间的平均电流（I），并除以单通道电流幅值（i）可获得通道开放频率（NPo），其中N为膜片中的通道数目，Po为通道的平均时间开放概率。

2 结果 2.1 重组质粒的鉴定

重组质粒pGEX-6p-3/C-lobe_E141G经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图见图 1。目的片段C-lobe_E141G约为240 bp，与图 1显示明显亮带位置相符，说明C-lobe_E141G目的片段扩增成功。DNA测序结果于NCBI数据库中进行Blast比对，结果显示，与Homo sapiens calmodulin 2（CALM2）相比，141位谷氨酸（E）对应的GAG碱基突变为甘氨酸（G）对应的GGG碱基（图 2），其他碱基比对结果一致。证明质粒构建成功。

2.2 C-lobe_E141G蛋白纯度和浓度的测定

结果如图 3所示，通过15% SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化后的C-lobe_E141G蛋白，条带位置与预期结果大概一致，且杂带较少即纯度较高。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度为0.98 g/L。

以上结果表明重组质粒能够高表达GST-C-lobe_E141G融合蛋白，纯化后获得高纯度、高浓度C-lobe_E141G蛋白。

2.3 C-lobe_E141G蛋白与CaV1.2钙通道preIQ片段的结合

GST pull-down结果显示，纯化后的C-lobe_E141G在2 mmol/L [Ca²⁺]条件下可与CaV1.2钙通道的preIQ片段浓度依赖性结合，表明本实验纯化的蛋白具有与CaV1.2钙通道结合的生物活性。见图 4。

2.4 C-lobe_E141G蛋白对心肌钙通道的作用

膜片钳单通道膜内向外（inside-out）模式下记录通道电流时，由于人为改变细胞内环境，通道活性会随着记录时间下降，即“run-down”现象。CaM及ATP是恢复钙通道“run-down”的必要因子^[22]。结果显示，纯化后C-lobe_E141G蛋白可恢复已“run-down”的心肌钙通道活性至169%，表明本研究纯化的蛋白具有维持钙通道开放的电生理活性。见图 5。

3 讨论

研究^[13]表明，编码相同CaM的3个基因（CALM1、CALM2和CALM3）中的任一个基因突变都会导致罕见的危及生命的心律失常综合征，统称为CaM病，包括LQTS、儿茶酚胺诱发的心动过速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT），特发性心室颤动（idiopathic ventricular fibrillation，IVF）及重叠特征表型等。2016年BOCZEK等^[23]首次报道CaM突变体E141G（CaM_E141G）导致C-lobe结构域的Ca²⁺亲和力降低，N-lobe的Ca²⁺亲和力没有显著变化；这不仅扰乱了CaV1.2通道的CDI作用，也可以使NaV 1.5后期电流增强，是第1个显示出会影响成年心脏钠通道亚型的CaM突变体。当共表达野生型CaM与突变体CaM_E141G时，NaV1.5晚钠电流被修复，然而，3倍过量的野生型CaM却无法修复突变体CaM_E141G导致的CaV1.2通道CDI异常^[23]。SU等^[17]进一步研究发现，和CaM相比，CaM_E141G与CaV1.2通道的结合减少；但是在低钙状态下CaM_E141G与CaM相比变化并不明显。

2013年以来，通过全外显子组测序相继发现了与LQTS相关的多种CaM致病突变体^[12-16]。有趣的是，已知的这些突变位点均位于CaM的C-lobe上，除F142为紧邻EF-hand4钙结合环的第1个氨基酸，其余均是EF-hand钙结合环内与钙共价结合的位点。JENSEN等^[24]利用Gnom AD数据库对138 632例基因筛查发现的28个CaM突变位点散在分布于整个CaM上，并且只有1个位点位于C-lobe的钙结合位点上，这些突变体未有LQTS表型。说明并不是CaM的所有突变都会导致LQTS，只有突变发生在C-lobe上，并且影响C-lobe结合钙的能力，才可能导致LQTS，而此现象背后的机制尚未阐明。

本课题组前期研究^[20]显示，CaM的N-lobe和C-lobe均可钙依赖性与CaV1.2通道结合而调节通道功能；当以CaM全长为研究对象研究CaM突变体E141G对CaV1.2功能的影响时，N-lobe仍保持一定的生理活性，尤其干扰在低钙条件下观察C-lobe突变对通道结合的影响。采用CaM截短蛋白C-lobe_E141G，可排除CaM的N-lobe对通道的调节，直接观察突变对CaM的C-lobe作用的影响。

综上所述，本研究成功构建LQTS相关C-lobe_E141G载体，并制备高浓度高纯度C-lobe_E141G蛋白，可作为研究LQTS相关的CaM突变位点集中于C-lobe结构域这一现象，以及CaM突变体通过其C环干扰CaV1.2通道CDI作用机制的基础。CaM突变引发的严重LQTS，临床上治疗的传统药物或方法（β受体阻断剂、苯妥英、螺内酯、钾以及单腔起搏器等）效果并不理想，因此寻找新的治疗靶点具有重要的临床意义。本研究为探究CaM突变引发的LQTS的发生机制及寻找新的治疗靶点提供了材料基础。