重度牙周炎困扰着全球超过10%的人口^[1]。牙周炎发生时单核巨噬细胞被激活并释放促炎因子，破骨细胞活性提高，引起牙周支持组织的吸收和破坏^[2]。近年来牙周炎的免疫调控受到了广泛关注，其通过干细胞、药物及其他方式作用于免疫微环境，使牙周炎症减轻、溶骨改善^[3]。调节巨噬细胞的迁徙和吞噬可作为治疗牙周炎的方法 ^[4-7]。

低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）可以促进骨折和骨不连愈合，其成骨作用的探索已深入分子机制水平^[8]。本课题组前期研究^[9]发现LIPUS通过激活钛酸钡材料的压电效应调控细胞内钙离子浓度，从而促进细胞成骨。近年来，LIPUS在炎症疾病中的治疗也受到关注。LIPUS能够促进炎症下肌肉组织的再生^[10]、抑制LPS诱导的成骨细胞炎症反应^[11]，并抑制白细胞介素-6和白细胞介素-8的表达^[12]。LIPUS可能影响巨噬细胞的迁徙和吞噬功能，改变炎症部位的巨噬细胞浸润和炎症反应，减轻牙周组织的炎症和损伤。本研究基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7活化观察加载超声对细胞迁徙及吞噬功能的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞

RAW264.7巨噬细胞由中国医科大学口腔医学院中心实验室提供。

1.1.2 主要仪器与试剂

超声加载仪器为Sonicator 740（美国Mettler Electronics公司），酶标仪Infinite F200（奥地利Tecan公司），流式细胞仪LSRFortessa（美国BD公司），EVOSTM XL Core成像系统（美国赛默飞公司），激光共聚焦显微镜C2（日本尼康公司），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（澳大利亚Scitcher公司），LPS（美国Sigma公司），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试剂盒（中国博士德公司），PE-CD206、APC-CD86（美国赛默飞公司），CCK-8试剂盒（美国APE×BIO公司），Transwell小室（中国洁特公司），结晶紫染色液（中国碧云天公司），pHrodo绿色荧光标记的大肠杆菌生物颗粒（美国赛默飞公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

用RPMI 1640培养基和胎牛血清按9∶1配成完全培养基，在5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养，细胞融合度达70%~80%时进行传代。

1.2.2 LPS体外诱导

用100、200和1 000 ng/mL LPS诱导RAW264.7细胞24 h。24 h后收集细胞上清液，用酶联免疫吸附试剂盒检测TNF-α的分泌水平；轻吹打细胞悬液并孵育流式抗体PE-CD206和APC-CD86；倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.2.3 LIPUS超声加载

将面积为10 cm²的超声探头置于水箱中，与水面的恒定高度差为5 cm。超声加载参照文献[13]报道中LIPUS治疗牙周炎所使用的参数。频率为1 MHz，强度为50 mW/cm²，脉冲宽度200 μs，脉冲频率100 Hz，20 min/次。假辐照为不开功率源，除此之外与实验组设置均一致。

1.2.4 细胞分组

将细胞分为未活化假辐照组（不加LPS，假辐照），未活化LIPUS组（不加LPS，加载超声），活化后假辐照组（加LPS，假辐照）以及活化后LIPUS组（加LPS，加载超声）。

1.2.5 CCK-8检测

将500 μL的RAW264.7悬液接种至24孔板。活化组巨噬细胞在接种时加入100 ng/mL LPS。超声加载为24 h内加载3次，间隔8 h。24 h后将培养基换为450 μL RPMI 1640+50 μL CCK-8工作液，孵育2 h后移入96孔板，在450 nm波长处测定吸光度值。

1.2.6 划痕实验

6孔板中细胞融合至80%时用200 μL枪头在皿中部划出划痕，更换培养基为仅含0.5% 胎牛血清的RPMI 1640并加载超声，24 h内加载3次，间隔8 h。0 h和24 h时间点倒置显微镜观察并拍摄照片。依据RAW264.7巨噬细胞划痕实验统计方法，结果用ImageJ软件进行分析。

1.2.7 Transwell实验

孔径为8 μm的Transwell小室下室为500 μL含LPS（1 μg/mL）的10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，上室为100 μL含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培养基的细胞悬液。超声加载为24 h内加载3次，间隔8 h。24 h后4%多聚甲醛固定小室15 min，结晶紫染色15 min后用棉签轻轻擦去上室的细胞。随机选择5个视野并计数其中完整的细胞个数。

1.2.8 吞噬实验

细胞接种于共聚焦小皿，待细胞贴壁后LPS（100 ng/mL）诱导24 h。加入1.5 L含pHrodo绿色荧光标记的大肠杆菌生物颗粒培养液。加载20 min超声后将共聚焦小皿37 ℃避光孵育，2 h后将小皿置于冰上终止吞噬，吸出含未被吞噬的生物颗粒的培养液，PBS洗涤3次，观察荧光素5-异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）荧光强度；收集细胞后流式细胞仪分析样品FITC荧光强度。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。服从正态分布且方差齐的数据，2组比较采用独立样本t检验；分析不同浓度LPS对RAW264.7细胞TNF-α分泌时采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 LPS诱导巨噬细胞的活化

LPS刺激RAW264.7细胞24 h后，随着浓度的提高，TNF-α分泌呈浓度依赖性增加。100 ng/mL的浓度诱导后TNF-α分泌增加，与未加LPS组相比有统计学差异（P < 0.05）；LPS浓度为500 ng/mL和1 μg/mL时，TNF-α分泌与未加LPS组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）（图 1A）。与未活化组相比，活化组CD206（M2抗炎型巨噬细胞表面标志物）/CD86（M1促炎型巨噬细胞表面标志物）的比值下降了1.28倍（P < 0.05）（图 1B）。此外，活化细胞形态改变，静止状态的RAW264.7为圆球形，呈片状生长。诱导后细胞体积增大，伪足伸出，见煎蛋样和梭形的活化巨噬细胞（图 1C）。

2.2 细胞活性

CCK-8检测结果显示，超声处理24 h时，活化组的RAW264.7细胞活性高于未活化组（P < 0.05）；与同时间点假辐照组相比，LIPUS组巨噬细胞的细胞活性无显著变化（图 2A）。

2.3 细胞迁徙

与假辐照组相比，加载LIPUS使划痕区域内巨噬细胞数目减少，其中未活化LIPUS组较未活化假辐照组巨噬细胞数目减少46.1%（P < 0.05）；活化后LIPUS组与假辐照组细胞数目无统计学差异（图 2B、2C）。Transwell实验中LIPUS组迁徙至下室的巨噬细胞数目少于假辐照组，LIPUS组Transwell下室中的细胞数为44.8±3.19，假辐照组为62.4±5.90（P < 0.01，图 2D、2E）。

2.4 细胞吞噬

孵育1 h时，FITC荧光强度较弱；2 h时FITC荧光明显。孵育2 h时活化组的巨噬细胞，可见被吞噬进入细胞内的生物颗粒有较强的FITC荧光信号，黏附在细胞膜和未被吞噬的生物颗粒不显示荧光。共聚焦显微镜下，LIPUS组与假辐照组相比，FITC荧光信号强度无统计学差异；流式结果显示，LIPUS组与假辐照组FITC平均荧光强度差异无统计学意义（P < 0.05），见图 3。

3 讨论

LIPUS是一种非侵入性的治疗仪，能将机械能转化为生物能并产生极少的热效应，应用于新鲜骨折和骨不连的愈合等领域^[8]。近来研究^[11-15]表明，LIPUS可能对巨噬细胞有免疫调节作用。ZHANG等^[12]通过60 mW/cm²强度加载LIPUS 2 h，LPS诱导U937巨噬细胞分泌的白细胞介素-6和白细胞介素-8被显著抑制。陈绩等^[14]发现LIPUS加载后巨噬细胞白细胞介素-6、白细胞介素-23α、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶的表达下降。但既往研究常关注于LIPUS抑制促炎因子的释放，在巨噬细胞迁徙方面，LIPUS的作用目前鲜见报道。本研究观察到LIPUS对巨噬细胞迁徙有抑制作用。CCK-8检验结果显示，在24 h的时间点，LIPUS并未影响巨噬细胞的细胞活力，表明LIPUS对巨噬细胞迁徙的抑制不是通过影响其细胞活力实现的。巨噬细胞是吞噬细胞的一种，吞噬是其重要的生物学功能。本研究结果显示，在当前LIPUS参数下，活化的RAW264.7吞噬能力升高；LIPUS组和假辐照组RAW264.7的吞噬能力无差异。关于LIPUS对巨噬细胞吞噬能力的影响，2008年和2021年分别有过相关报道^[12，15]。ZHOU等^[15]发现，在小鼠J774A.1巨噬细胞和人原代巨噬细胞，LIPUS以30 mW/cm²强度、1.5 MHz频率加载20 min和40 min时，LIPUS组FITC标记的大肠杆菌荧光强度明显强于假辐照组，且超声加载后细胞骨架蛋白F-actin聚合明显增加。这一结果与本研究结论不同，可能有以下原因：巨噬细胞的选择不同，RAW264.7与J774A.1可能对超声刺激反应不同，吞噬E.coli颗粒的能力有所差异；其次，ZHOU等^[15]的研究选择20 min和40 min作为吞噬观察时间点，本研究为2 h。本研究结果显示，pHrodo E.coli生物颗粒在 < 1 h时未被内化进入RAW264.7巨噬细胞内，故无法在超声加载20 min的时间点进行即刻比较；除此之外，在LIPUS参数的选择上，ZHOU等^[15]使用的LIPUS仪器提供的频率为1.5 MHz，而Sonicator 740提供的频率为1.0 MHz。有研究^[16]表明，LIPUS不同频率的加载可对细胞膜面积及细胞伸展等产生影响。在另一项小鼠骨髓来源的巨噬细胞的吞噬研究^[10]中，加载LIPUS后进行LPS诱导，发现LIPUS组细胞的脂滴吞噬能力小于假辐照组，LIPUS下调了LPS激活的NF-κB/MAPK通路相关蛋白的表达。虽然同样也使用了LPS诱导的巨噬细胞模型，但在吞噬颗粒、LIPUS参数、巨噬细胞选择等方面也与本研究不同。

炎性疾病常伴随着巨噬细胞过度聚集的现象，如类风湿性关节炎、牙周炎等。滑膜腔内巨噬细胞数目是评价类风湿性关节炎的标志，疾病改善时滑膜腔内巨噬细胞数目减少^[17]。调整巨噬细胞的迁徙模式可能有利于减轻慢性炎性疾病。研究^[4]表明巨噬细胞迁徙抑制剂宾达利可缓解牙周炎小鼠的牙槽骨吸收，使牙周上皮厚度增加。因此，调节巨噬细胞迁徙可能在抑制炎症上起重要作用。本研究采用物理治疗的方法，与手术治疗相比更为安全温和，结果显示LIPUS对巨噬细胞迁徙的抑制作用，这可能对炎性疾病，如牙周炎的的治疗提供新思路。然而，LIPUS抑制炎性环境下细胞迁徙的分子机制尚不明确。研究^[18]表明，LIPUS可抑制LPS作用下p38 MAPK和ERK通路的激活。p38 MAPK信号通路可参与巨噬细胞的细胞骨架重塑并影响LPS诱导下巨噬细胞促炎因子释放和细胞迁徙^[19]。因此，在体内外模型中LIPUS对巨噬细胞相关信号通路的影响有待研究，以进一步明确LIPUS在炎性环境下调控巨噬细胞迁徙的分子作用机制。