糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病引发的视网膜微血管并发症，是导致成年人视力障碍和失明的主要原因^[1]。目前，DR的治疗手段包括视网膜激光光凝治疗和玻璃体切除手术，但这些方法只能缓解症状，并不能阻止疾病进展^[2]。因此，明确DR的发病机制，探索DR治疗的新方法至关重要。DR的发病机制复杂，涉及多种活性物质和信号通路。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有显著的促新生血管形成作用，在DR演进过程中备受关注^[3-4]。在DR早期，环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）作为促炎基因，诱导下游炎性细胞因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）释放，进而引起VEGF表达升高，促进视网膜新生血管生成。红景天苷是中红景天中的一种有效成分，具有抗氧化、抗炎症及神经保护等功效，可以有效靶向DR引起的视网膜氧化应激、炎症反应和神经细胞损伤^[5-6]。本研究探讨红景天苷通过COX-2/PGE2/VEGF通路对糖尿病大鼠视网膜病变的影响，为DR治疗提供研究思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

32只雄性SD大鼠由锦州医科大学实验动物中心提供，体质量（230±20）g。将SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组及红景天苷低、高剂量（50、200 mg/kg）组，每组8只。本研究获得锦州医科大学实验动物伦理委员会审查批准。

1.1.2 主要药品与试剂

红景天苷购自大连美伦生物科技公司；COX-2、VEGF引物购自上海生工公司；COX-2抗体购自英国Abcam公司；逆转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒（2×SYBR Green PCR Mastermix），PGE2、ELISA试剂盒购自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立与分组

对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水，其余3组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病模型，浓度为65 mg/kg。72 h后，测量血糖浓度为 > 16.7 mmol/L认为大鼠糖尿病模型构建成功。红景天苷低、高剂量组大鼠分别按照50、200 mg/kg剂量灌胃给予红景天苷（1次/d），对照组及糖尿病组大鼠给予等量的生理盐水。每隔2周检测并记录血糖及体质量，连续给药12周。

1.2.2 样本制备

各组给药结束后，用4%戊巴比妥钠麻醉处死各组大鼠，4%多聚甲醛灌注后迅速摘除大鼠两侧眼球。石蜡包埋视网膜后切片，厚度约为5 μm，横跨整个视网膜。4 ℃保存。

1.2.3 免疫荧光

视网膜切片脱蜡、浸水、抗原修复、PBS洗3次及1%山羊血清封闭。使用一抗COX-2在湿盒中4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次。避光条件下加入荧光二抗，37 ℃孵育60 min。PBS洗涤、封闭，图像采集。

1.2.4 实时荧光定量PCR

采用TRIzol提取各组大鼠视网膜总RNA。合成cDNA加入引物，经DNA聚合酶进行扩增。以GAPDH为内参，分析COX-2和VEGF mRNA表达水平。引物序列见表 1。

1.2.5 ELISA检测PGE2的分泌

大鼠处死后，快速分离视网膜组织，在RIPA缓冲液中充分裂解。根据ELISA试剂盒说明书步骤操作，在酶标仪450 nm波长处测光密度值（optical density，OD）值。

1.2.6 Western blotting检测COX-2和VEGF的蛋白表达

10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜，室温封闭1 h，孵育一抗（1∶2 000稀释）过夜。在室温条件下孵育二抗（1∶5 000稀释）1 h，TBST洗3次，显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行数据分析，计量资料以X±s表示，所有实验均重复3次。采用单因素方差分析评估多组间差异，组内差异比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠体质量和血糖情况

连续给药12周后，与对照组比较，糖尿病组大鼠血糖显著升高（P < 0.01），体质量显著减轻（P < 0.01）。与糖尿病组比较，红景天苷低剂量组（P < 0.05）、红景天苷高剂量组（P < 0.01）大鼠血糖均有所降低，体质量均有所增加。见表 2。

2.2 各组大鼠视网膜组织病理改变

HE染色结果显示，对照组大鼠视网膜组织各层细胞形态正常，排列较为整齐。糖尿病组大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGC）层有空泡样改变，内核层及外核层细胞排列紊乱、稀疏。红景天苷低剂量组大鼠的RGC紊乱状态有所改善，内核层及外核层细胞排列较糖尿病组紧密。红景天苷高剂量组大鼠视网膜组织病理改变进一步减轻。见图 1。

2.3 各组大鼠RGC密度改变

对照组RGC密度值为（206.12±21.54）/mm²，糖尿病组为（150.60±17.13）/mm²，与对照组相比，糖尿病组RGC密度显著降低（P < 0.05）。红景天苷低剂量组（155.45±22.49）/mm²，红景天苷高剂量组（190.78±15.79）/mm²。与糖尿病组相比，红景天苷低剂量RGC密度变化不显著（P > 0.05），但随着红景天苷剂量的增多，红景天苷高剂量组RGC密度显著增多（P < 0.05）。

2.4 各组大鼠COX-2和VEGF mRNA表达情况

对照组COX-2和VEGF mRNA相对表达量分别为（1.07±0.06）和（1.06±0.05），糖尿病组COX-2和VEGF mRNA相对表达量分别（2.40±0.20）和（3.99±0.48）。与对照组相比，糖尿病组COX-2和VEGF mRNA表达水平均显著升高（P < 0.01）。红景天苷低剂量组COX-2和VEGF mRNA相对表达量分别为（1.58±0.09）和（1.60±0.51），红景天苷高剂量组COX-2和VEGF mRNA相对表达量分别为（1.43±0.07）和（1.80±0.16）。与糖尿病组相比，红景天苷低、高剂量组COX-2和VEGF mRNA表达水平均显著降低（P < 0.05）。

2.5 各组COX-2和VEGF蛋白表达情况

Western blotting结果显示，与对照组相比，糖尿病组COX-2、VEGF蛋白表达显著升高（P < 0.01）。与糖尿病组相比，红景天苷低剂量组COX-2、VEGF蛋白表达变化不显著（P > 0.05），但随着红景天苷剂量的增多，红景天苷高剂量组COX-2、VEGF蛋白表达显著降低，且2个剂量组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 2。

2.6 各组大鼠PGE2分泌情况

对照组、糖尿病组PGE2分别为（113.15±12.07）pg/mL、（241.12±33.74）pg/mL。与对照组相比，糖尿病组PGE2表达水平均显著升高（P < 0.01）。红景天苷低剂量组、高剂量组PGE2分别为（179.06±30.30）pg/mL、（160.07±24.71）pg/mL。与糖尿病组相比，红景天苷低、高剂量组PGE2表达均显著降低（P < 0.05，P < 0.01）。

3 讨论

DR已经影响了全球50%的1型糖尿病和30%的2型糖尿病^[7-8]，是最具破坏性的糖尿病微血管并发症之一，能够引起视网膜不可逆的损伤。虽然目前DR的治疗已经取得了一定的进展，但现有的临床治疗效果并不理想^[9]。YAO等^[10]研究表明，红景天苷治疗可以降低糖尿病小鼠视网膜氧化应激水平，缓解糖尿病小鼠眼底微血管病变，保护视网膜正常屏障功能。本研究红景天苷按照50、200 mg/kg剂量灌胃糖尿病大鼠，发现与糖尿病组相比，红景天苷组大鼠的视网膜层结构、细胞形态以及排列程度均得到一定程度的改善。此外，红景天苷高剂量组大鼠视网膜RGC密度显著增多，与YAO等^[10]研究结果一致，表明红景天苷对DR具有保护作用。

长期高血糖的刺激导致视网膜缺血缺氧，引发炎症反应及新生血管形成^[11]。有研究^[12]表明，在DR早期促炎基因主要表达于缺血视网膜。其中COX-2作为促炎基因在疾病早期高水平表达，诱导PEG2的合成，进而调节VEGF的表达，并进一步诱导病理性血管生成。VEGF被认为是DR过程中重要的调节因子，VEGF的过表达与DR患者的血管高通透性和新生血管形成有关，是DR形成的关键因素之一。因此，抑制COX-2的表达是防止DR进展的关键。WU等^[13]研究发现，红景天苷可以与COX-2直接结合，抑制COX-2的表达从而减轻紫外线诱导小鼠表皮JB6Cl41细胞及人皮肤角质形成细胞的炎症反应。本研究建立糖尿病大鼠视网膜病变模型，观察红景天苷对视网膜组织中COX-2/PGE2/VEGF通路表达的影响。结果显示，与糖尿病组相比，红景天苷高剂量组COX-2、PGE2和VEGF表达显著降低。

综上所述，本研究探讨了红景天苷对糖尿病大鼠视网膜病变的影响，结果显示红景天苷治疗可抑制DR大鼠视网膜组织中COX-2/PGE2/VEGF信号通路，改善糖尿病大鼠视网膜组织病理改变，为红景天苷的临床用药及DR的综合防治提供了思路。