2023, Vol. 52文章信息
- 郭晓莉, 杜燕, 李莎莎, 袁二磊
- GUO Xiaoli, DU Yan, LI Shasha, YUAN Erlei
- miR-494-3p靶向调控RCAN1对高糖诱导的足细胞损伤的影响
- RCAN1-targeted effects of miR-494-3p on high glucose-induced podocyte injury
- 中国医科大学学报, 2023, 52(8): 711-717
- Journal of China Medical University, 2023, 52(8): 711-717
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文章历史
- 收稿日期：2022-11-08
- 网络出版时间：2023-07-28 15:18:16
引用本文 |
2. 西安医学院第一附属医院肾脏内科, 西安 710077;
3. 陕西双博中医肝肾病医院肾脏内科, 西安 710016
2. Department of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an 710077, China;
3. Department of Nephrology, Shaanxi Shuangbo Hospital of HepatoRenal Diseases, Xi'an 710016, China
糖尿病肾病是糖尿病并发症之一，足细胞损伤与糖尿病肾病的发生发展密切相关。持续高血糖水平可增加炎性细胞因子分泌量、促进细胞凋亡，进而造成足细胞损伤[1-2]。微RNA（microRNA，miRNA）是一种小的非编码RNA，调节基因表达，参与糖尿病肾病和终末期肾病的发生和发展[3-4]。据研究[5-6]报道，miRNA与足细胞损伤有关，并可作为糖尿病肾病诊断的潜在生物标志物。miR-494-3p在心脏手术相关急性肾损伤中表达上调，可靶向HtrA3，增加缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导的人肾小管上皮细胞HK-2中的炎症反应[7]。最近的研究[8]显示，在db/db小鼠肾组织和高糖（high glucose，HG）处理的人肾小管上皮细胞HK-2中，miR-494-3p水平上调，抑制miR-494-3p可减轻HG诱导的细胞功能障碍。但miR-494-3p在糖尿病肾病中的作用机制尚不完全清楚。StarBase数据库预测显示，miR-494-3p与钙调磷酸酶调节蛋白1（regulator of calcineurin 1，RCAN1）存在互补序列，RCAN1是miR-494-3p的潜在靶基因。RCAN1已被报道在人类糖尿病肾病、IgA肾病和狼疮性肾炎的肾小球以及人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）相关肾病和糖尿病肾病的小鼠模型中表达受到抑制；RCAN1抑制会加重足细胞损伤[9]。在HG诱导的足细胞中，RCAN1表达下调，上调其表达可减轻足细胞损伤[10]。然而，miR-494-3p能否通过调控RCAN1减轻糖尿病肾病足细胞损伤还未见相关报道。因此，本研究拟探讨miR-494-3p是否可通过靶向调控RCAN1表达而影响HG诱导的足细胞损伤。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠肾足细胞MPC5购自美国ATCC公司；LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen公司；TRIzol Universal、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂、SuperReal荧光定量预混试剂彩色版（SYBR Green）购自天根生化科技（北京）有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-494-3p、miR-NC、miR-494-3p mimic购自广州锐博生物技术有限公司；pcDNA、RCAN1过表达载体购自上海吉玛制药技术有限公司；凋亡检测试剂盒、荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Sigma公司；野生型载体Wt-RCAN1、突变型载体Mut-RCAN1购自美国Promega公司；白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）检测试剂盒、内参GAPDH抗体、IgG二抗购自美国Abcam公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗体购自美国CST公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养及分组MPC5细胞于含5.3 mmol/L葡萄糖培养基内培养24 h，记为NC组。加入含有30 mmol/L葡萄糖培养基培养24 h[11]，记为HG组。参照LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent说明书，将anti-miR-NC、anti-miR-494-3p、pcDNA、RCAN1过表达载体分别转染至MPC5细胞，48 h后收集细胞，用含30 mmol/L葡萄糖培养基培养24 h，分别记为HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-494-3p组、HG+pcDNA组、HG+RCAN1组。anti-miR-494-3p和si-NC、si-RCAN1分别共转染至MPC5细胞，48 h后收集细胞，用含30 mmol/L葡萄糖培养基培养24 h，分别记为HG+anti-miR-494-3p+si-NC组、HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1组。
1.2.2 qRT-PCR检测miR-494-3p、RCAN1 mRNA的表达水平用TRIzol Universal提取各组MPC5细胞总RNA，用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA（miRNA专用），FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂合成cDNA（用于检测RCAN1），SuperReal荧光定量预混试剂彩色版（SYBR Green）进行定量检测，2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组MPC5细胞，弃上清，细胞沉淀中加入500 μL结合缓冲液重悬，按照凋亡检测试剂盒说明书检测凋亡率。
1.2.4 ELISA法检测IL-1β、TNF-α水平取各组MPC5细胞培养上清液，ELISA法检测IL-1β、TNF-α水平，按照试剂盒说明书操作。
1.2.5 双荧光素酶报告实验检测miR-494-3p与RCAN1的靶向关系将miR-494-3p与RCAN1结合位点的序列克隆至pGL3，构建野生型载体Wt-RCAN1。用点突变试剂盒对结合位点进行突变，将突变位点的序列克隆至pGL3，构建突变型载体Mut-RCAN1。用LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent分别共转染miR-NC/miR-494-3p mimics、Wt-RCAN1/Mut-RCAN1至MPC5细胞，24 h后检测细胞荧光素酶活性。
1.2.6 Western blotting检测Bcl-2、Bax、RCAN1蛋白表达量取MPC5细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白，100 ℃变性10 min，取30 μg蛋白行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶800）、RCAN1（1∶1 000）一抗、内参GAPDH抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3 000），37 ℃孵育2 h。用Quantity One软件对蛋白条带进行定量。
1.3 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料均符合正态分布，采用X±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-494-3p在HG诱导的小鼠足细胞中的表达与NC组比较，HG组miR-494-3p表达量升高（2.26±0.19 vs 0.99±0.08，P < 0.05）；与HG+anti-miR-NC组比较，HG+anti-miR-494-3p组miR-494-3p表达量降低（1.38±0.12 vs 2.30±0.21，P < 0.05）。
2.2 沉默miR-494-3p对HG诱导的小鼠足细胞损伤的影响与NC组比较，HG组凋亡率、Bax蛋白水平、IL-1β、TNF-α水平升高（P < 0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P < 0.05）；与HG+anti-miR-NC组比较，HG+anti-miR-494-3p组凋亡率、Bax蛋白水平、IL-1β、TNF-α水平降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P < 0.05）。见图 1、表 1。
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| A, apoptosis rate; B, Bcl-2 and Bax protein expression. 图 1 沉默miR-494-3p对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 Fig.1 Effect of silencing miR-494-3p on apoptosis of mouse podocytes induced by high glucose |
| Group | Apoptosis rate（%） | Bcl-2 | Bax | IL-1β（ng/L） | TNF-α（ng/L） |
| NC | 6.71±0.43 | 0.88±0.09 | 0.19±0.03 | 41.38±3.74 | 62.17±5.82 |
| HG | 28.47±2.251） | 0.42±0.051） | 0.57±0.061） | 98.52±7.911） | 125.43±10.391） |
| HG+anti-miR-NC | 28.62±2.49 | 0.39±0.04 | 0.59±0.05 | 94.59±8.28 | 121.42±11.56 |
| HG+anti-miR-494-3p | 13.44±1.522） | 0.61±0.052） | 0.33±0.042） | 62.77±5.642） | 92.36±7.572） |
| F | 317.315 | 124.490 | 156.837 | 150.231 | 93.562 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 1）compared with NC group，P < 0.05；2）compared with HG+anti-miR-NC group，P < 0.05. | |||||
2.3 miR-494-3p靶向RCAN1
miR-494-3p和RCAN1存在结合位点，见图 2。双荧光素酶实验结果显示，共转染Wt-RCAN1与miR-494-3p mimic的MPC5细胞荧光素酶活性较共转染Wt-RCAN1与miR-NC的MPC5细胞荧光素酶活性降低（0.41±0.06 vs 0.99±0.10，t = 14.920，P < 0.05），共转染Mut-RCAN1与miR-494-3p mimics的MPC5细胞荧光素酶活性较共转染Mut-RCAN1与miR-NC的MPC5细胞荧光素酶活性无统计学差异（0.99±0.09 vs 1.02±0.10，t = 0.669，P > 0.05）。
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| 图 2 miR-494-3p和RCAN1相互结合的位点 Fig.2 The binding sites of miR-494-3p and RCAN1 |
2.4 miR-494-3p靶向负调控RCAN1
与NC组比较，HG组RCAN1 mRNA及蛋白水平降低（P < 0.05）；与HG+anti-miR-NC组比较，HG+anti-miR-494-3p组RCAN1 mRNA及蛋白水平升高（P < 0.05），见图 3、表 2。
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| 图 3 RCAN1蛋白表达 Fig.3 Expression of RCAN1 protein |
| Group | RCAN1 mRNA | RCAN1 protein |
| NC | 1.00±0.09 | 0.83±0.07 |
| HG | 0.35±0.061） | 0.20±0.031） |
| HG+anti-miR-NC | 0.37±0.04 | 0.22±0.04 |
| HG+anti-miR-494-3p | 0.75±0.062） | 0.59±0.052） |
| F | 210.267 | 338.182 |
| P | < 0.001 | < 0.001 |
| 1）compared with NC group，P < 0.05；2）compared with HG+anti-miR-NC group，P < 0.05. | ||
2.5 上调RCAN1对HG诱导的小鼠足细胞损伤的影响
与HG+pcDNA组比较，HG+RCAN1组凋亡率、Bax蛋白水平、IL-1β、TNF-α水平降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P < 0.05），见图 4、表 3。
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| , apoptosis rate; B, RCAN1, Bcl-2 and Bax protein expression. 图 4 上调RCAN1对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 Fig.4 Effect of upregulation of RCAN1 on apoptosis of mouse podocytes induced by high glucose |
| Group | RCAN1 mRNA | RCAN1 protein | Apoptosis rate（%） | Bcl-2 | Bax | IL-1β（ng/L） | TNF-α（ng/L） |
| HG+pcDNA | 0.34±0.05 | 0.24±0.03 | 27.52±3.07 | 0.39±0.04 | 0.58±0.07 | 95.77±9.42 | 124.39±11.23 |
| HG+RCAN1 | 0.88±0.04 | 0.63±0.07 | 12.38±1.50 | 0.56±0.05 | 0.29±0.03 | 57.36±6.71 | 89.47±8.52 |
| t | 25.300 | 15.363 | 13.293 | 7.965 | 11.424 | 9.963 | 7.432 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
2.6 下调RCAN1可逆转沉默miR-494-3p对HG诱导的小鼠足细胞损伤的影响
与HG+anti-miR-494-3p+si-NC组比较，HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1组凋亡率、Bax蛋白水平、IL-1β、TNF-α水平升高（P < 0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P < 0.05），见图 5、表 4。
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| A, apoptosis rate; B, RCAN1, Bcl-2 and Bax protein expression. 1, HG+anti-miR-494-3p+si-NC; 2, HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1. 图 5 下调RCAN1可逆转沉默miR-494-3p对HG诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 Fig.5 Down-regulation of RCAN1 reversed the effect of silencing miR-494-3p on the apoptosis of mouse podocytes induced by high glucose |
| Group | RCAN1 mRNA | RCAN1 protein | Apoptosis rate（%） | Bcl-2 | Bax | IL-1β（ng/L） | TNF-α（ng/L） |
| HG+anti-miR-494-3p+si-NC | 0.76±0.08 | 0.60±0.04 | 13.26±1.19 | 0.62±0.06 | 0.32±0.04 | 61.59±5.74 | 87.26±8.58 |
| HG+anti-miR-494-3p+si-RCAN1 | 0.38±0.03 | 0.27±0.05 | 19.58±1.63 | 0.45±0.03 | 0.50±0.03 | 80.55±7.18 | 117.36±10.26 |
| t | 13.343 | 15.461 | 9.395 | 7.603 | 10.800 | 6.188 | 6.752 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
3 讨论
miRNA与糖尿病肾病密切相关，可作为疾病诊断的生物标志物和治疗靶点[12-13]。在HG诱导的足细胞损伤中有miR-15b-5p[14]、miR-770-5p[15]和miR-21-5p[16]等多种miRNA存在异常表达。因此，对异常miRNA的调控是治疗糖尿病肾病的重要策略。miR-494-3p在肾损伤中存在高表达，具有一定的临床诊断价值[17-18]。在糖尿病大鼠心肌细胞中，miR-494-3p呈高表达，与高脂程度呈正相关，并可促进胰岛素抵抗的发生[19]。此外，在HG诱导的HK-2细胞中miR-494-3p表达上调，抑制其表达可减轻细胞功能障碍[8]。本研究结果显示，HG诱导的MPC5细胞凋亡率、Bax蛋白水平升高，Bcl-2表达下调，与既往研究[20]结果相似，表明成功建立足细胞损伤模型。本研究发现，HG诱导的MPC5细胞中miR-494-3p表达上调，提示miR-494-3p可能参与HG诱导的足细胞损伤。而沉默miR-494-3p可减弱HG对MPC5细胞凋亡的促进作用，提示沉默miR-494-3p可抑制HG诱导的MPC5细胞凋亡，与以往的研究一致，再次证实了miR-494-3p可能参与糖尿病肾病发生过程。IL-1β、TNF-α水平升高可促进足细胞损伤，引起足细胞功能障碍[21-22]。本研究结果显示，HG诱导的MPC5细胞中IL-1β、TNF-α水平升高，沉默miR-494-3p可降低IL-1β、TNF-α水平，提示沉默miR-494-3p可抑制HG诱导的MPC5细胞炎症反应。这可能与miR-494-3p表达状态有关，其水平升高可引起足细胞功能障碍，促进细胞凋亡、炎性细胞因子分泌，造成细胞损伤。
RCAN1是一种多功能蛋白，参与神经退行性变、炎症和细胞凋亡[23-25]。在心血管疾病中，RCAN1呈低表达，可作为心血管疾病治疗的潜在靶点[26]。在肾脏疾病中，RCAN1表达水平降低，上调其表达可降低活化T细胞核因子转录活性，稳定肌动蛋白细胞骨架组织，减轻阿霉素诱导的足细胞损伤[9]。此外，RCAN1是炎症反应的重要调节因子[27]。升高的RCAN1可抑制氧糖剥夺诱导的星形胶质细胞中NF-κB的活化和核转移，减轻炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，而RCAN1沉默则具有相反的作用[28]。本研究显示，在HG处理的MPC5细胞中，RCAN1水平降低，上调其表达可抑制细胞凋亡及炎性细胞因子表达，提示上调RCAN1表达可抑制炎症反应和细胞凋亡，对HG诱导的足细胞损伤具有保护作用。
miRNA是基因表达的重要转录后调节剂，能特异性结合下游靶基因mRNA的3’UTR，抑制靶基因翻译、表达[29-31]。本研究通过生物信息学预测发现miR-494-3p与RCAN1序列存在互补的结合位点，双荧光素酶实验结果证实miR-494-3p可靶向结合RCAN1，并负向调控RCAN1表达，由此推测miR-494-3p/RCAN1在足细胞损伤中可能发挥重要调控作用。为了验证此推测，本研究在沉默miR-494-3p的基础上，采用小分子干扰技术下调RCAN1表达。结果发现，RCAN1表达的下调可减弱沉默miR-494-3p对HG诱导的MPC5细胞凋亡、炎性细胞因子表达的抑制作用。提示miR-494-3p靶向调控RCAN1促进HG诱导的MPC5细胞损伤。
综上所述，沉默miR-494-3p可通过促进RCAN1表达而抑制HG诱导的MPC5细胞凋亡及炎症反应。本研究首次证实了miR-494-3p可靶向调控RCAN1参与HG诱导的足细胞损伤，为进一步阐释糖尿病肾病的调节机制提供了理论基础，可为糖尿病肾病治疗提供新方向。
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