2023, Vol. 52文章信息
- 尤佳琪, 刘畅, 崇巍
- YOU Jiaqi, LIU Chang, CHONG Wei
- Tubastatin A通过降低氧化应激减轻脓毒症所致心肌损伤的体外研究
- Effect of tubastatin A on attenuating myocardial cell damage in sepsis by reducing oxidative stress in vitro
- 中国医科大学学报, 2023, 52(7): 633-637
- Journal of China Medical University, 2023, 52(7): 633-637
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文章历史
- 收稿日期：2023-01-11
- 网络出版时间：2023-07-06 14:12:59
引用本文 |
研究[1]显示，40%~50%脓毒症患者可发生心肌抑制，其中的7%会发生心力衰竭。目前，对于脓毒症所致心功能障碍的机制尚未明确，普遍认为心肌抑制与脓毒症时的炎症介质、线粒体功能障碍和氧化应激损伤等有关，但确切机制仍不清楚[2]。生理条件下，心脏组织中活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成很少[3]，然而在缺氧、高糖、炎症等刺激下ROS大量产生[3-6]。脓毒症时，循环中病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）、损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）共同作用于心肌细胞[7]，通过诱导胞内的黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）、NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）活化和线粒体损伤产生ROS[8]。过量的ROS引起心肌细胞氧化应激损伤[9]。Tubstatin A（Tub A）是组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）选择性抑制剂[10]，本课题组密歇根大学合作伙伴发现Tub A可以提高致死性脓毒症大鼠的远期生存率[11]。有研究[12-16]表明，Tub A可以减少心肌细胞、星形胶质细胞、乳腺上皮细胞等ROS的产生，减轻炎症反应，从而对细胞发挥保护作用。
本研究应用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬细胞获得细胞上清液，用其刺激心肌细胞，建立体外脓毒症心肌损伤模型，并用Tub A进行干预，探讨Tub A对脓毒症心肌细胞氧化应激损伤的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞培养及分组RAW264.7巨噬细胞购自美国ATCC公司，培养条件为完全培养基（DMEM高糖培养基+10%FBS+1%青链霉素），37 ℃，5% CO2以及饱和湿度孵箱。巨噬细胞生长达80%左右接触率时饥饿培养（DMEM高糖培养基+0.5%FBS+1%青链霉素）过夜，用1 μg/mL LPS（L8247，美国Sigma公司）刺激8 h后取上清液获得心肌细胞培养基（MCM组）；用无LPS刺激的巨噬细胞8 h后取上清液获得心肌细胞培养基（Sham组），两种上清液4 ℃保存备用。
用完全培养基培养H9C2心肌细胞（美国ATCC公司），培养条件与RAW264.7巨噬细胞一致。待H9C2生长达80%左右接触率并饥饿过夜后，Sham组用无LPS刺激的巨噬细胞上清液培养；MCM组用LPS刺激巨噬细胞所获上清液培养；Tub A组预处理（饥饿培养基+40 μmol/L Tub A）3 h，正式处理（MCM组应用的培养基+40 μmol/L Tub A）孵育24 h[17-18]，收集心肌细胞及上清液检测相关指标。
1.2 巨噬细胞上清液中一氧化氮（nitric oxide，NO）水平检测应用总NO含量检测试剂盒（S0024，中国碧云天公司）检测，操作按照说明书步骤进行。酶标仪（美国Biotec公司）测定样本在540 nm的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。
1.3 心肌细胞活性检测将Sham组、MCM组、Tub A组和空白对照组（饥饿培养基培养的心肌细胞）按照1×104/孔接种到96孔板并饥饿过夜后给予相应刺激。在各孔中加入10 μL的CCK8试剂（日本同仁化工公司），混匀后放回孵箱，2 h后拿出96孔板，酶标仪测定样本在450 nm处的吸光度值。
1.4 流式细胞仪检测心肌细胞内ROS水平收集各组心肌细胞制备细胞悬液，应用ROS检测试剂盒（CA1410，中国索莱宝公司）将DCFH-DA探针装载入心肌细胞内（阴性对照除外），应用流式细胞仪检测荧光强度，用FITC通道检测2，7-二氯荧光素（2，7-dichlorofluorescein，DCF）荧光，应用Flow Jo软件分析结果。
1.5 心肌细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测收集各组心肌细胞，检测MDA含量。按照试剂盒（BC0025，中国索莱宝公司）说明书步骤进行操作，检测心肌细胞内MDA含量，应用酶标仪测定样本在532 nm和600 nm处的吸光度值。各组分别计算：ΔA532=A532测定-A532空白，ΔA600=A600测定-A600空白，ΔA=ΔA532-ΔA600；MDA含量（nmol/107cell）=107.5×ΔA。
1.6 细胞释放的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测按照试剂盒（BC0685，中国索莱宝公司）说明书检测2组巨噬细胞上清液中以及各组心肌细胞上清液中的LDH，应用酶标仪测定样本在450 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。心肌细胞所产生的LDH=LDH（心肌细胞上清液）-LDH（所用的巨噬细胞上清液）。
1.7 心肌细胞释放心肌型肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）检测收集各组心肌细胞上清液，按照试剂盒（SEKR-0059，中国索莱宝公司）说明书步骤检测CK-MB水平，应用酶标仪测定样本在450 nm、630 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品浓度。巨噬细胞不产生CK-MB，因此心肌细胞上清液中的CK-MB是心肌细胞产生的。
1.8 统计学分析应用Excel 2016录入数据，计量资料采用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MCM组和Sham组巨噬细胞上清液中NO水平结果显示，MCM组和Sham组巨噬细胞上清液NO含量分别为（16.27±3.57）μmol/L、（0.90±0.68）μmol/L，2组比较差异有统计学意义（P < 0.001）。
2.2 各组心肌细胞氧化应激水平比较检测各组细胞ROS荧光强度，以阳性对照组荧光强度峰值为标准，测量各组大于该荧光强度的细胞占比。结果显示，阳性对照组、Sham组、MCM组、Tub A组、阴性对照组细胞占比分别为46.2%、22.9%、33.0%、22.5%和0。见图 1A。对各组平均荧光强度进行定量分析，结果显示MCM组荧光强度显著高于Sham组和Tub A组（均P < 0.05），而Sham组和Tub A组荧光强度比较无统计学差异（P > 0.05），见图 1B。与Sham组比较，MCM组心肌细胞中MDA含量显著增加（P < 0.05）；与MCM组比较，Tub A组MDA含量显著减少（P < 0.05）。见图 1C。
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| A，peak of intracellular ROS fluorescence intensity；B，cell fluorescence intensity；C，intracellular MDA content. ***P < 0.001. 图 1 各组心肌细胞中ROS及MDA水平比较 Fig.1 Comparison of ROS and MDA levels in each group |
2.3 各组心肌细胞损伤情况比较
与Sham组比较，MCM组心肌细胞释放的LDH水平明显升高（P < 0.05）；与MCM组比较，Tub A组LDH水平明显下降（P < 0.05），见图 2A。与Sham组比较，MCM组CK-MB水平明显升高（P < 0.05），与MCM组比较，Tub A组CK-MB水平有下降趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2B。
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| A，LDH；B，CK-MB. *P < 0.05；***P < 0.001. 图 2 各组心肌细胞损伤情况比较 Fig.2 Comparison of myocardial cell injury in each group |
2.4 各组心肌细胞活性比较
结果显示，空白对照组与Sham组比较心肌细胞活性无统计学差异（P > 0.05）。与Sham组比较，MCM组与Tub A组心肌细胞活性明显降低（P < 0.001）；与MCM组比较，Tub A组心肌细胞活性明显升高（P < 0.001），见图 3。
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| ***P < 0.001. 图 3 各组心肌细胞活性比较 Fig.3 Comparison of myocardial cell activity in each group |
3 讨论 3.1 经LPS刺激的巨噬细胞可以导致心肌细胞氧化应激和损伤
本研究结果显示，使用经LPS刺激巨噬细胞的上清液培养心肌细胞后，细胞内ROS及脂质过氧化产物MDA水平均显著增加，LDH和CK-MB释放明显增加，同时细胞活性明显下降，提示经LPS刺激的巨噬细胞可以导致心肌细胞氧化应激和损伤。
JI等[16]、RUAN等[18]研究结果与本研究相似，经LPS刺激的巨噬细胞使心肌细胞发生氧化应激损伤，加剧细胞的炎症反应。过量产生的ROS可抑制线粒体氧化磷酸化，减少细胞内ATP的产生，使细胞活性下降。另外，磷脂膜对ROS的攻击十分敏感，可发生脂质过氧化，产生MDA和4-羟基壬烯酸等脂质过氧化产物[19]，这些产物可以破坏DNA、蛋白质和酶活性，并激活信号通路，引发细胞的自噬、凋亡、铁死亡等[20]；大量ROS导致脂质过氧化还可破坏细胞膜结构，导致通透性增加，大量释放心肌酶及其他细胞损伤标志物[21]。
3.2 Tub A可减轻经LPS刺激的巨噬细胞所致的心肌细胞氧化应激和损伤本研究结果显示，应用Tub A对心肌细胞进行干预后，细胞内ROS及脂质过氧化产物MDA水平均明显降低，细胞释放LDH明显减少，CK-MB作为临床和体外实验中诊断脓毒症心肌损害的关键指标，同样呈下降趋势。此前已有研究[14]证实，Tub A在星形胶质细胞、乳腺上皮细胞等的脓毒症模型中具有减轻氧化应激损伤的作用，且在缺氧/复氧的H9C2心肌细胞中也具有减少ROS产生的作用[17]，因此Tub A可能通过降低细胞的氧化应激水平，减轻经LPS刺激的巨噬细胞所致的心肌细胞损伤。
大量研究证实，巨噬细胞受LPS等刺激发生M1极化，形成促炎表型，产生促炎性细胞因子，而NO可作为巨噬细胞发生M1极化的标志物之一。本研究中LPS刺激后的RAW264.7巨噬细胞产生大量NO，可以认为其发生了M1极化，形成促炎表型。脓毒症引起的靶器官损伤来自于PAMPs、DAMPs的共同作用[7]。本研究应用LPS刺激巨噬细胞获得的上清液，同时具备了PAMPs和DAMPs，模拟脓毒症时复杂的内环境，成功构建体外细胞模型，符合脓毒症心肌损害的病理机制。此外，众多研究[22-24]表明，氧化应激损伤是脓毒症心肌损害发生的重要病理生理过程，即心肌细胞内ROS、MDA含量、心肌细胞损伤标志物的释放水平及细胞活性的改变，与本研究结果一致。JI等[16]、RUAN等[18]同样应用本研究方法成功建立了脓毒症心肌损害体外模型，故应用此方法建立体外脓毒症心肌损伤模型具有较高科学性。
综上所述，心肌损伤作为急诊科常见的脓毒症并发症，其发生机制与氧化应激损伤有着十分密切的关系。Tub A可以通过减少ROS的产生，减轻脓毒症导致的心肌细胞氧化应激损伤，进而保护心肌细胞，提高心肌细胞的生存率，维持心脏功能的稳定。本研究为体外实验，无法完全模拟复杂的体内过程，因此有待体内实验进一步验证。
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