阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称为老人失智症、老年痴呆症、脑退化症，是最常见的神经退行性疾病。目前，AD已成为世界上最常见的痴呆类型之一。且随着世界老龄化人口增加，AD发病率逐年上升。由于AD暂无有效的防治手段，给患者家庭和社会均带来沉重的经济负担。因此，找到AD的发病原因并寻找有效的预防手段尤其重要^[1]。

AD的病因不明，其主要病理特征为神经元内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结和胞外剪切生成的以β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成的老年斑^[2-3]。大量研究结果显示，炎症反应是AD发病的主要原因之一，脑内沉积的Aβ可通过与神经胶质细胞上的受体结合，激活星形胶质细胞和小胶质细胞，释放大量炎性细胞因子和趋化因子，炎性细胞因子包括NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β等。这些炎性细胞因子可进一步促进淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）向淀粉样蛋白剪切途径进行，促使Aβ生成增多，最终形成恶性循环，加快AD的进程^[4-5]。

近年来，针对AD的治疗药物越来越多，主要包括胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐等）、谷氨酸受体拮抗剂（美金刚）以及甘露特纳，但是这些药物都无法达到预期的治疗效果，且存在潜在的不良反应^[6-7]。鼠尾草酸（carnosic acid，CA）主要存在于鼠尾草和迷迭香等植物中，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用^[8-10]。研究^[11]发现，CA能够抑制多种皮肤炎症，且对人体无毒。此外，CA能够通过降低TNF-α的表达，抑制细胞内炎症反应^[12]。因此，CA可能具有广泛的抗炎作用。然而，CA能否通过降低神经炎症反应减少Aβ生成和沉积数量，进而延缓AD的病理进程，尚未见报道。因此，本研究通过给予AD小鼠CA，研究CA对AD的影响，并探索其是否可以通过核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制小鼠大脑皮层免疫炎症反应，从而改善AD小鼠的认知功能障碍，最终延缓AD的发病进程。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 药品和试剂盒

CA，购自中国MedChemExpress公司；NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB、p-NF-κB、Aβ抗体、β-actin、二抗、Alexa Fluor 555标记的荧光二抗，购自美国Cell Signaling Technology公司。IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒，购自美国Abcam公司。

1.1.2 仪器

Morris水迷宫，购自中国安徽正华生物仪器设备有限公司；激光共聚焦显微镜，购自日本尼康公司；酶标仪，购自美国伯腾仪器有限公司。

1.1.3 实验动物和分组

5月龄APP/PS1转基因小鼠（AD模型）18只，购自北京华阜康生物科技有限公司，体质量25~28 g。将18只小鼠分为对照组和CA组，每组9只。CA组：腹腔注射CA（20 mg·kg^-1·d^-1），连续注射2个月；对照组：腹腔注射相同体积的生理盐水，连续注射2个月。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫实验

实验分为3个时期。训练期为2 d，3次/d，每次间隔1 h；可视平台期为5 d，3次/d，每次间隔1 h；第8天为隐蔽平台期，移走平台，记录小鼠穿越原来平台位置的次数。每只小鼠进行3次实验。

1.2.2 组织取材

10%水合氯醛（10 g/3 μL）麻醉小鼠，待小鼠进入深度麻醉状态（手术镊子夹小鼠四肢未见反应即可），立刻将小鼠固定于解剖台上。剖开胸腔并剪去横膈膜，暴露心脏，在左心室左下角开一个小口，将灌流针由左心室插入主动脉，并用止血钳固定住针头，剪开右心耳，立即用0.9% NaCl灌流，灌流4~6 min，至肝脏边缘无血丝为止。迅速断头，剖取小鼠大脑，于冰上一分为二。一部分放入4%多聚甲醛中固定保存，用于免疫组织化学中的形态学检测；另一部分放入-80 ℃冰箱保存，用于蛋白提取、Western blotting等分子生物学检测。

1.2.3 Western blotting

前额皮层组织称重，加入RIPA裂解液（内含蛋白酶抑制和磷酸酶抑制剂）后进行超声破碎。破碎后，放置冰上裂解3~4 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，进行蛋白质定量后深度低温保存，用于Western blotting检测。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶，转膜完成后，PVDF膜用2%脱脂牛奶封闭，抗体4 ℃孵育过夜。第2天二抗室温孵育45 min，洗膜，ECL发光并显影。

1.2.4 免疫荧光染色

切片水化后，用羊血清封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。荧光二抗室温孵育2 h，PBS漂洗后，防荧光淬灭剂封片，显微镜下采集图像。

1.2.5 ELISA检测

按照试剂盒操作，测定小鼠皮层中炎性细胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 统计学分析

采用Prism7.0软件进行统计学分析。数据用x±s表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CA对AD小鼠学习记忆能力的调控

水迷宫实验结果显示，对照组小鼠和CA组小鼠寻找可视平台的时间无统计学差异（P > 0.05），说明2组小鼠的运动能力和视力无显著差异。隐蔽平台实验结果显示，与对照组相比，CA组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P < 0.05），说明CA可提高小鼠的记忆能力，且可明显缓解AD小鼠的空间记忆损伤（P < 0.05）。见图 1。

2.2 CA对AD小鼠大脑皮层中Aβ沉积数量和胶质细胞活化的影响

免疫荧光双标记染色结果显示，对照组小鼠的大脑皮层出现大量Aβ老年斑沉积，并且其周围的神经胶质细胞明显增多。与对照组相比，CA组小鼠大脑皮层中Aβ老年斑数量明显减少，星形胶质细胞和小胶质细胞明显减少。说明CA可能通过抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减少Aβ的生成，进而延缓AD的发病进程。见图 2、3。

2.3 CA对AD小鼠大脑皮层中炎性细胞因子的影响

ELISA结果（图 4）显示，与对照组相比，CA组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。Western blotting结果（图 5）进一步证实，与对照组相比，CA组小鼠NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平明显降低（P < 0.05），CA抑制NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。说明CA可明显抑制AD小鼠脑内炎症反应。

2.4 CA通过NF-κB信号通路抑制AD小鼠脑内炎性细胞因子表达

与对照组相比，CA组p-NF-κB的表达明显降低（P < 0.05）。说明CA可能通过NF-κB信号通路抑制AD小鼠免疫炎症反应，进而改善小鼠的学习记忆能力。见图 6。

3 讨论

Aβ形成过程中伴随着神经胶质细胞活化，产生大量的炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等。而小胶质细胞持续激活削弱了其结合和吞噬Aβ的能力，并降低Aβ的降解，进一步增加Aβ的沉积数量，加快AD的发病进程。

NF-κB在神经系统中神经元损伤的细胞反应中发挥重要作用。NF-κB通过调节细胞因子和免疫应答基因的转录来调节免疫。在刺激作用下，NF-κB从细胞质转位到细胞核，诱导靶基因转录^[13]。重要的是，AD患者死后脑退化细胞中可见明显的NF-κB活化。在胶质增生过程中，Aβ神经毒性依赖于NF-κB ^[14]。相反，阻断NF-κB可减轻IL-1β诱导的变性^[15]。NF-κB抑制被认为是减少神经炎症损伤，从而延缓AD发病进程的潜在靶点。

CA是一种天然化合物，是从迷迭香中分离得到的一种酚类二萜，因其药理作用而受到越来越多的关注。研究^[9]证实，CA可逆转Aβ引起的海马神经元损伤，进而起到保护神经元的作用。此外，CA可通过抑制神经胶质细胞产生的炎性细胞因子，改善AD小鼠的认知功能障碍。

本研究检测了炎性细胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，结果发现，与对照组相比，CA组NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表达明显降低，p-NF-κB表达明显降低，提示CA可能通过NF-κB信号通路抑制炎性细胞因子的表达，进而抑制AD小鼠脑内的免疫炎症反应，最终延缓AD的病理进程。免疫荧光双标记染色结果进一步揭示，CA可抑制AD小鼠脑内Aβ的生成以及减少Aβ的沉积数量，抑制神经胶质细胞的活化。行为学实验证实，CA改善AD小鼠的认知功能障碍，为今后在临床上CA防治AD提供实验基础和理论依据。

综上所述，本研究结果表明，CA可通过抑制APP/PS1转基因小鼠脑内免疫炎症反应，进而减少AD小鼠脑内的Aβ沉积数量，最终改善AD的认知功能障碍。本研究为CA今后用于防治AD提供了有力的理论依据。