泛素是一类由76个氨基酸组成的高度保守的蛋白质，分子量约为8.5×10³，广泛存在于所有真核细胞中。泛素分子携带7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，底物蛋白可以在一个或多个位点的赖氨酸残基进行泛素化，底物蛋白结合的赖氨酸残基不同，底物蛋白的去向不同。泛素化修饰是一个主要由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3等介导的多级酶联反应。首先，E1利用ATP提供的能量，在泛素C端赖氨酸残基上的羧基基团与自身的半胱氨酸残基上的巯基基团间形成高能硫酯键，从而活化泛素分子。然后，激活的泛素通过硫酯键被接合到E2的半胱氨酸残基上。最终，激活的泛素或者通过E2直接连接到蛋白底物上，或是在E3作用下，通过泛素的羧基末端与靶蛋白赖氨酸残基的氨基之间形成氨基异肽键，将泛素转移到靶蛋白上。在这一系列酶促级联反应中，E3在靶蛋白的特异性识别以及泛素化系统的调控中起最重要的作用。根据E3的特征结构域及泛素传递到靶蛋白的作用机制，E3被分为3个家族类型：含RING finger结构域的E3、含HECT结构域的E3以及含U-box结构域的E3 ^[1-4]。泛素化参与体内各种蛋白质的降解和(或) 信号通路的变化，调控机体的各种生理功能^[5-6]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 是由Erbb-1基因编码的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受体，参与细胞增殖、有丝分裂等，在肿瘤发展、肿瘤靶向治疗药物耐药中起重要作用。EGFR具有3个蛋白结构域，包括胞外配体结合结构域、疏水跨膜结构域和胞浆酪氨酸激酶结构域。EGFR通过结合各种细胞外表皮生长因子配体如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) 和转化生长因子(transforming growth factor，TGF) 而被激活，导致其形成二聚体，二聚体刺激受体固有的酪氨酸激酶活性，并触发自磷酸化。随后，受体传递细胞反应，介导各种细胞活动，包括细胞增殖、分化、存活和生长。EGFR基因扩增或突变、基因重排和不同剪接变异体的产生是EGFR参与肿瘤转化或癌症进展的重要途径^[7-11]。EGFR可以通过配体结合泛素化的方式，进行翻译后修饰。目前发现有多种E3参与EGFR的泛素化修饰，直接参与EGFR蛋白降解、介导EGFR通路信号改变、增强EGFR蛋白稳定性等，泛素后的EGFR可经蛋白酶体途径、网格蛋白介导的或非网格蛋白介导的内吞途径降解^[12]。

1 野生型EGFR蛋白的泛素化修饰 1.1 Casitas B家系淋巴瘤(casitas B-lineage lymphoma，Cbl) 家族为最早鉴定的泛素EGFR的E3

泛素连接酶Cbl家族成员(Cbl、Cbl-b和Cbl-c) 是受体酪氨酸激酶的负性调节因子，Cbl家族蛋白依赖性泛素化在配体诱导溶酶体靶向和降解中发挥重要作用。其中，Cbl-c联合表皮生长因子受体途径底物15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 15，EPS15) 中功能性泛素相互作用基序来介导EGFR的内吞。Cbl-c结合于EPS15中功能性泛素相互作用基序，募集活化的EGFR进入含有EPS15的囊泡。泛素后的EGFR复合物作为EPS15的对接位点，将受体招募到网格蛋白的囊泡中。Cbl-c可以通过2种不同的机制引导泛素化的EGFR进入含有EPS15的内化路径：一种为依赖直接与EGFR结合的Cbl-c的磷酸酪氨酸结合区域；另一种为依赖锌指结构的C端，从而间接结合于受体。因此，Cbl-c介导EPS15参与活化后EGFR的内吞降解^[13]。

1.2 具有RING finger结构域的生长调节剂1 (cell growth regulator with ring finger domain 1，CGRRF1)在乳腺癌中调控EGFR泛素化

CGRRF1是一种生长抑制因子，由一个跨膜结构域和一个RING finger结构域组成。许多含有RING finger结构域的蛋白质具有E3的功能，可以将泛素从E2转移到底物蛋白上。CGRRF1在体内和体外都能抑制乳腺癌的生长，敲除CGRRF1基因可促进乳腺癌细胞系的生长，过表达CGRRF1基因可以抑制乳腺癌细胞系的生长，RING finger结构域对其生长抑制活性至关重要。在异种移植实验中，过表达CGRRF1基因的异种移植细胞中EGFR表达较低，相反，在CGRRF1基因敲除或敲低细胞中EGFR表达增强。CGRRF1通过K48链接的泛素化作用使EGFR泛素化，从而导致EGFR通过蛋白酶体降解^[14]。

1.3 瞬时受体电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1) 在胰腺癌中调控EGFR泛素化

TRPV1首先在感觉神经元中被发现，它被认为是缓解疼痛的治疗靶点。在胰腺癌细胞PANC-1中，过表达TRPV1基因后，EGFR表达降低，然而沉默TRPV1基因后，EGFR表达增加。TRPV1基因过表达抑制细胞增殖，显著降低KRAS和AKT2两种癌基因的mRNA水平。更重要的是，TRPV1通过诱导EGFR泛素化和降解来下调EGFR水平，从而调节胰腺癌细胞中EGFR/MAPK信号通路。这些结果揭示了TRPV1对胰腺癌细胞EGFR的调控作用及其机制，为设计新的靶向EGFR的抗胰腺癌药物提供了新思路^[15]。

1.4 包含HECT、UBA和WWE结构域的蛋白1 (HECT，UBA，and WWE domain-containing protein 1，HUWE1)促进EGFR泛素化和降解

HUWE1是一个分子量约为482×10³的E3，被认为具有肿瘤促进和(或)肿瘤抑制功能。TGF-β1是肾脏纤维化的关键介质，它抑制HK-2细胞中HUWE1表达，增加EGFR表达。HUWE1与EGFR相互作用，过表达HUWE1基因的HK-2细胞中，EGFR蛋白显著降低，而EGFR mRNA未显著降低，表明HUWE1对EGFR的下调发生在翻译后水平。用MG132处理HK-2细胞以抑制蛋白质降解时，EGFR表达增加，这表明HUWE1对EGFR的调控与蛋白质降解泛素-蛋白酶体途径之间存在联系。HK-2细胞中，HUWE1基因过表达诱导EGFR蛋白的半衰期缩短。EGFR蛋白在HUWE1基因过表达的HK-2细胞中，偶联的泛素量是载体控制细胞中的2倍多，这表明HUWE1是参与EGFR降解的E3^[16]。

1.5 环指蛋白144A (ring finger protein 144A，RNF144A) 促进EGFR泛素化并维持EGFR稳定

RNF144A是一种含RING finger结构域的E3，RNF144A包含1个RING finger结构域和1~2个跨膜结构域。在几种类型癌症中，RNF144A的表达与EGFR mRNA和蛋白水平呈正相关。EGFR的配体诱导RNF144A和EGFR相互作用。RNF144A在EGF刺激过程中促进EGFR泛素化，维持EGFR稳定性，延长EGF/EGFR信号转导。通过多种方法消耗RNF144A，会导致EGFR表达和EGF/EGFR信号转导的降低。RNF144A的消耗减少了依赖EGF的细胞增殖^[17]。

1.6 Smad泛素化调节因子2 (Smad ubiquitination regulatory factor 2，SMURF2) 促进EGFR泛素化并维持EGFR稳定

SMURF2是一种HECT型E3，SMURF2可以泛素化EGFR，但通过保护EGFR不受Cbl-c介导的降解而稳定EGFR。相反，小干扰RNA介导的SMURF2基因敲除会使EGFR蛋白不稳定，诱导自噬反应，并降低表达EGFR的癌细胞的存活率，而对EGFR阴性癌细胞、正常成纤维细胞和正常上皮细胞的影响极小。头颈部鳞状癌细胞UMSCC74B在裸鼠体内形成侵袭性肿瘤，在小干扰RNA介导的SMURF2基因敲除后，其体内成瘤能力显著丧失。EGFR和SMURF2 mRNA和蛋白表达具有很强的相关性。这些结果表明，SMURF2介导的EGFR泛素化可能是某些肿瘤中EGFR高表达的原因，并支持靶向SMURF2-EGFR相互作用作为治疗EGFR依赖性肿瘤的新治疗方法^[19]。

1.7 假性激酶Tribble 3 (pseudokinase Tribble 3，TRIB3) 招募含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1 (WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1) 促进EGFR泛素化并维持EGFR稳定

TRIB3作为一种压力传感器，对各种压力源做出反应，通过与信号转导蛋白和功能蛋白相互作用，参与慢性炎症、代谢和恶性疾病。TRIB3通过与自噬受体P62相互作用，破坏自噬体和蛋白酶体降解癌细胞中蛋白质的功能，从而促进几种肿瘤的发生和发展。TRIB3缺失导致多种肿瘤促进因子(包括EGFR) 表达显著降低。TRIB3基因过表达增强K63链接的EGFR泛素化，并且修饰发生在EGFR的近膜区。TRIB3与EGFR相互作用，招募蛋白激酶C-α，使EGFR在T654位点磷酸化，导致WWP1催化K63链接的K689泛素化EGFR，增强EGFR的再循环，从而增强了EGFR的稳定性，促进肿瘤的进展^[20]。

2 突变型EGFR蛋白的泛素化修饰 2.1 Hsc70相互作用蛋白的C端(C-terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP) 促进突变的EGFR泛素化和降解

CHIP是一个HSP70/HSP90共伴侣，具有E3活性。CHIP自身的E3活性独立于HSP70/HSP90。CHIP选择性地与EGFR突变体(G719S、L747_E749del A750P和L858R) 相互作用，降低其表达。CHIP的U-box结构域具有E3活性，是EGFR突变体通过泛素化下调所必需的。CHIP在肺腺癌细胞中选择性相互作用，并下调内源性EGFR突变体。CHIP降低细胞增殖和致瘤性，尤其是在EGFR突变的非小细胞肺癌细胞系中。CHIP基因过表达抑制了EGFR突变株的细胞增殖和异种移植瘤的生长，但对野生型EGFR细胞株没有抑制作用。EGFR突变体特异性泛素化修饰，可能是肺腺癌中EGFR调控的重要机制。CHIP可以有望成为克服EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI) 耐药的新的治疗靶点^[21]。

2.2 姜黄素促进EGFR泛素化和降解

姜黄素是一种名为二氟乙烯基甲烷的天然化合物，可以通过多种机制抑制细胞周期进程、诱导细胞凋亡和抗转移。姜黄素还通过调节EGFR蛋白水平下调前列腺癌细胞中的EGFR信号，表明姜黄素抑制内在的EGFR酪氨酸激酶活性，抑制配体诱导的EGFR激活。姜黄素能通过泛素化野生型EGFR和突变型EGFR (T790M细胞)，诱导EGFR蛋白降解。姜黄素诱导的EGFR降解，可能通过增强吉非替尼耐药细胞的泛素-蛋白酶体能力来实现^[22]。

2.3 SMURF2促进突变的EGFR泛素化并维持突变的EGFR稳定

SMURF2与EGFR相互作用，对EGFR的稳定性和TKI的反应至关重要。L858R/T790M突变的EGFR优先被SMURF2-UBCH5 (一种E3-E2介导的多聚泛素化) 稳定。4个赖氨酸残基作为泛素化位点，用拟乙酰化的谷氨酰胺取代其中一个残基，会增加突变体EGFR对厄洛替尼诱导的降解敏感性。在肺癌细胞株中，SMURF2基因过表达增加了L858R/T790M突变的EGFR蛋白水平，增加了TKI耐受性，而SMURF2基因敲低可降低L858R/T790M突变的EGFR蛋白水平，使肺癌细胞对TKI敏感。总体来说，SMURF2介导的L858R/T790M突变的EGFR多聚泛素化可能与乙酰化介导的受体内化相竞争，而后者与增强受体稳定性相关。因此，SMURF2增强L858R/T790M突变的EGFR蛋白的稳定性和对TKI的抗性^[23]。

3 展望

泛素对蛋白质的共价修饰在维持蛋白稳态、参与蛋白定位和转位、调控蛋白活性和蛋白相关作用等方面扮演重要角色，使细胞对外部和内部刺激变化做出迅速、敏感的反应。蛋白质泛素化修饰广泛参与细胞周期、细胞凋亡、转录因子调控、细胞内吞等病理生理过程，为更好地认知蛋白质的功能提供更宽泛的视角。EGFR的泛素化修饰被认为与EGFR的膜定位、降解、活化和内吞等过程密切相关。一般认为EGFR的泛素化为多位点的单泛素化，其泛素化形式包括以K48链为主和以K63链为主的2种不同形式。其中，K48链泛素化易被26S蛋白酶体识别和降解，而K63链泛素化则可被内吞体分选转运复合体识别，诱导EGFR通过细胞内吞作用转运至内涵体，并进一步通过溶酶体降解^[24-25]。这一过程在下调EGFR相关通路及信号转导、负性调控酪氨酸酶等过程中发挥至关重要的作用。Cbl家族是既往研究最为广泛的泛素EGFR的E3。除此之外，近年来越来越多的证据表明，仍有部分E3参与EGFR泛素化过程，系统梳理其种类和功能，从而为进一步寻找新的临床靶点提供基础依据。EGFR及其下游通路的异常活化是泛素化中广泛存在的驱动因素，目前针对EGFR的抑制剂已被广泛用于临床，如针对非小细胞肺癌中EGFR通路的TKI，已被临床指南推荐作为EGFR敏感突变的一线治疗首选。然而，目前第3代TKI奥西替尼在临床治疗中的主要瓶颈为治疗后耐药，其耐药形式主要以EGFR通路依赖的突变为主，如20外显子的C797S突变、20外显子插入突变、18外显子G724S突变以及EGFR扩增等^[26]。因此，从泛素化蛋白降解的角度下调EGFR水平，成为扭转耐药的关键。

近年来被广泛关注的蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera，PROTACT) 人工合成异源嵌合型分子，是针对EGFR TKI耐药后治疗策略的研究热点。PROTACT技术是以招募靶蛋白相关E3为基础，靶向识别目的蛋白，并通过泛素化降解靶蛋白的方法。目前，针对不同突变类型的EGFR蛋白的PROTACT分子研发正在开展广泛的基础研究，并已获得初步研究结果^[27]。因此，加强对EGFR E3的理解和分析，能够促进寻找靶向泛素-蛋白酶体系统治疗新靶点，为拓宽基础研究和临床策略提供多角度的理解和思路。